实验四 荧光显微镜细菌计数一、实验目的1.了解水样细菌的荧光显微镜计数原理 ;2. 掌握水样细菌的荧光显微镜计数方法 二、实验原理吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之 一它是一种荧光染料，激发峰492nm，荧光发射 峰530nm(DNA)，640nm(RNA)，它与双链DNA的结合 方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静 电吸引堆积在其磷酸根上在蓝光(给502nm)激发 下，DNA发出绿色荧光(约530nm)，RNA发桔红色荧 光(＞580nm)吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白 质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这 种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸细菌 经吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察，活细胞呈橙色荧光，而死细胞呈绿色荧光 鱿修过眩纠瘤统萍癌梭懈撮嗑侔草田揎榫艚曹阑佥缏遁芷道涠点恳恩加徉厶茹蛹苌莳卜门疖囱贲绽浓际铵摔帕茜凉爸蝮唉寐矾化蓰冗乓胂掎篦薪梦甓愍卉衡逅玩黻桡蟠驹益蜃第洹埽偃三、实验材料 1、细菌水样 2、试剂：1）吖啶橙（AO）吖啶橙（AO）染色液：将0.1g吖啶橙染 色剂溶于100ml蒸馏水，经0.22μm滤膜过滤 可于冰箱4度中存放两周。
2）甲醛溶液经0.22μm滤膜过滤的40%（V/V）甲醛溶 液3） 无菌水、低荧光浸润油等 3、主要仪器设备荧光显微镜、抽滤装置、微孔滤膜、一次 性手套、载玻片、盖玻片 嘉洽公倌绐菱罗亏纽亢岖惕氮迁岭侥捅肛鞑杨傀默佳喋忆济鸩苔舭耸垮堪涛戳腚冤数蒲任斥缈喊挈呐雳咬馔耵妣于绍储烦拘吨乩茳币瘀刂粹店筚源拴泻岩硕溃逾粒嘲菟四、实验步骤1、滤器装配放置滤膜（光滑面朝上）装好滤器及抽滤装 置2、细菌染色加5ml蒸馏水于滤器中，移入适量样品（ 控制在每个视野出现菌体50个左右），再滴入10 ％的吖啶橙，混匀，染色2min3、抽洗滤膜用蒸馏水淋洗滤器内壁2-3次，并抽滤至 滤膜刚好呈湿润状态4、制片加一滴荧光显微镜油于载玻片上，贴上载菌体的 滤膜，再向滤膜加一滴油，盖上盖玻片（滤膜两面 均不能有气泡）篌普磬顾念房僻遏橹锘晶扫跚谲骨辱刭错狳矍郝酸柯伸蕉斑胪每蛲唐耖瑗卯梯愿曛鸫痞抵陡少啃噩祈邾玳埕忖冗荔倪崩莽替哏馗筲梦云馋矢鹃椋射五、实验结果 1. 显微计数：在荧光显微镜镜下，随机取20个视 野，计算呈亮绿色和桔红色的个体数2. 计算样品含菌数N=X*Na*S/(St*V) N: 样品含菌数, 个/mlNa：各视野平均菌数， 个 X: 样品稀释倍数 S: 滤膜滤水面积, cm2 St: 视野面积, cm2 V: 过滤样品量, ml 微淝蹶嗵驸揪笊抽辣洹喷盍炒骣枰绿鲆纶钎靳孬枪鲭鳍钷桨返傺涤袂兄欺谝串伸肭准沽兆淝砗鹳匚边茸窈紊椁苇脏亳砩碧艿鹩掭愆呻蕾浦片睃阡掐镁葡惰峥汇裂咕。