皮肤科范式转变：共倍距激光扫描显微镜在临床皮肤科和外科的应用SALVADOR GONZALEZ, MD, PhD KIRSTY SWINDELLS, MD MILIND RAJADHYAKSHA, PhD ABEL TORRES, MD摘要：皮肤科和皮肤病理科H前的 工作方法是从患者身上获取组织经处理和染色后，对病检组织进行诊断这种方法需要对微细组织进行高分辨率观察，存在一定程度的风险和弊端如 今的图像技术可对患者的皮损进行在体、无创、高分辨率的实吋成像在这些检 查方法中，与常规组织学检查相比，共聚焦显微镜模式提供了最高分辨率的图像 可以做到真正的无创，在自然、动态的状态下观察皮肤这篇文章刈川于皮肤科 和皮肤外科的在体共焦距成像原理进行了综述如今皮肤科使用的许多诊断方法都依赖于切除皮肤组织后经处理进行病理组 织的显微成像此方法现在已经发展为一种很成熟的技术了，可提供皮肤组织高 分辨率的细胞和亚细胞水平的精细结构然而此方法需要做皮肤组织活检，活检术给患者带來了痛苦，费时，医疗成本增加，而II只能 得到切除后的组织信息，存在疤痕形成和感染的风险传统的活检需要对活检的 样本进行处理和染色，这样有可能导致样本失真。
近期影像技术的发展为无创性、高分辨率、在体皮肤成像提供了发展空间，避 免了活检后做病理检查的不足之处这些进展包括光学相干断层扫描仪、高频超 声皮肤诊断仪，磁共振成像和激光共聚焦显微镜(RCM)上述各种方法中，与 传统的病理组织学的检查方法相比，RCM提供的图像分辨率最高不会因为对样品的处理或染色受到影响，减少了伪像形成实时收集到的数据 要比传统的组织学检查更加省吋，同一皮肤检查部位可在不同吋间段多次成像， 以观察其动态的变化，如病变区域对治疗的反应共聚焦激光扫描显微镜工作原理为使用一个点光源照射皮肤组织，在组织内照 射产牛一个小光斑然后将反射光通过一个针孔后在探测器上成像针孔阻挡了 非聚焦光到达探测器上这也表明了只有标本区域的聚焦光能被探测到形成需 要观察样本的完整图像，通过点光源束扫描完成，得到一个在体的、超薄的水平 方向组织的虚拟切片RCM的分辨率取决于针孔大小，光学显微镜的数值孔径, 以及所使用的波长使用不同波长的激光作为共聚焦激光扫描显微镜的光源激 光波长数值大时，对皮肤的穿透性强，但是横向分辨力降低了因为当组织中折 射率在同一点有所差杲吋，以及当组织结构产牛的反射光与照射光照波长大小相 似吋，就产牛了光的后向散射。
如实验室中所使用的近红外光波长(800-1064nm) 照射黑色索后能产牛较强的后向散射，虽然黑色索对该波长的吸收较强，其形成 原因是黑素周围的表皮组织的折射率高，近似与照明光波长这表明含黑色素的 细胞，如基底角质形成细胞和黑素细胞成像时折射强血与Z相反的是，皮肤或 色素性病变经照射成像后图像亮度低共聚焦激光扫描显微镜的工作原理Marvin Minsky于1955年在哈佛大学作博士后研究员吋发明了共聚焦激光扫描 显微镜然而，这一新技术还需要相应的光源和计算机技术，才能使在体组织成 像检查得以实现自上个世纪80年代以来，有几个科研组织展示了如何使用经 串联后的共聚焦激光扫描显微镜在人体和动物组织进行在体成像于1995年最 先报告了共聚焦激光扫描显微镜用于皮肤组织在体成像相比于传统病理组织检 查，在体RCM检查有以下几个优势：无痛、非创、活检组织不受损皮肤组织检查结果1学检查有二点不同：1.所获得的图像为横断面成像，类似于Mohs外科的水平 断层，而非传统组织学检查的纵向断层2.所获得的图像为类似于X光成像的 灰阶影像RCM的观察视野不同于放大镜，多为250-500 gm0通过某个特定深 度的组织形态外观或通过测量成像深度来确定扫描的切面，可使用连接在物镜z stage上的千分尺测量。
从皮肤表而开始逐层对皮肤进行实吋扫描，所获得最浅表的图像为皮肤角质 层因浸渍介质（如水的折射率是1.33）和皮肤角质层（折射率为1.54）交界的界 面形成的折射率差导致大量向后散射的光，会产牛光度很强的图像（近似于白色涂料）激光照射剂量低吋可避免产牛此现象角质层的 形态学表现为直径10・30中n的无核多边形角质细胞，细胞成巢，由皮沟将其分 开，图像较喑（图2A）O看到的第二层为颗粒层，由2・4层直径为25-35大小的 细胞组成在这层能看到细胞中央黑色椭圆形的细胞核，周边环绕着呈颗粒状的 细胞质，光度较强（图2B）角质层下20-100pm处为棘层由一些直径为15-25gm 的较小细胞紧密排列形成蜂'窝状，细胞间边界分明（图2C）O所看到的表皮最深 层即基底层，直径为7-lOgm的细胞成巢，光度较强进一步进行深层成像时， 位于真皮和表皮交界处的suprapapillary epidermal plate （真皮乳头JL方的表皮） 呈现为环形，明亮的基底细胞，周围环绕着深色的真皮乳头，其表现为与真皮乳 头血管环一致的血流中心部分（图2D）能看到真皮浅层的网状纤维交织成网和 一些小血管正常皮肤能观察到的其他特征还有汗腺导管，其特征呈背景明亮的 中心空洞结构，螺旋状上升通过表皮和真皮，其他能观察到的还有毛干和毛囊皮 脂腺单位。
以上皮肤附属器呈现有螺纹状的小心空洞结构，在其周径上表现为拉 长的椭圆形细胞，长长的毛干中心有反射止常皮肤扫描图像因不同的扫描部位和肤色而有所不同如皮肤暴露部位或色 素沉着部位通常反射率较强，这是因为基底层中色素含量较高同吋皮肤暴露部 位角质层增厚，有更多的裂隙或皱褶，无序排列形成的真皮乳头，巢状的真皮细 胞呈网格状排列，与胶原纤维和弹性纤维结构一致角质形成细胞的厚度变化也 很明显，皮肤暴露部位的厚度明显高于非暴露部位手掌和脚掌的角质层很厚， 有大量汁腺管为特征性表现图1•激光扫描共聚焦显微镜光路模式图阐述了成像原理，为一种皮肤横断面 （聚焦）切片的无创性成像检查设备照射到皮肤后产牛的反射光在探测器上成 像，而非穿透皮肤的光检测器前端的小孔（针孔）只能接受由焦点反射回来的 的光线，非焦点反射光则被遮挡掉现在市场销售的RCM波长为830nm,物镜:NA0.9,30xo横向分辨率约为1中m 轴向分辨力（切片厚度）为3-5pmo凭借这个系统，就可以在深度为200・250pm 范围内对正常皮肤成像这个成像深度完全能满足表皮和真皮上层的成像（真皮 乳头和网状纤维）如果使用较大能量的激光，也可获得更深层皮肤的图像。
1-1 前可供商业使用的激光能量小于30mV,不会造成皮肤组织或眼睛的损伤因为 水的折射率（1.33）接近于表皮的折射率，这会减少光通过组织与空气间界面时 所产牛的球而像差，因此需要将镜头浸在水小检查操作也可用水基凝胶做浸渍 介质，特别是在对鳞片状或角化后的皮损成像时，因为凝胶分散在受损的角质细 胞中会减少不同物质界面的不规则性扫描-•个凹凸不平的皮肤点吋也需要使用 凝胶，原因是凝胶不会像水那样在皮肤表面随意流动与皮肤接触的仪器在使用 时应避免因移动而造成伪影，因此使用时用水或凝胶做浸溃介质设备有以下部 件组成：一个用粘着剂固定在患者皮肤上的金展环，成像吋与一个磁体形成共扼 显微装置一个凹槽盛浸渍介质通过移动物镜沿Z轴平面上下对皮肤扫描成 像，在皮肤纽织不同水平面上都能成像，其机制是将物镜焦平面渐进性移向皮肤 深层扫描捕捉到的图像既可以以皮肤水平切面的静态图片显示，还可以进行视 频成像后存储（20-30HZ）,以显示一些组织如血流的动态变化共聚焦激光扫描显微镜观察非肿瘤性皮损我们使用RCM鉴别临床上许多增牛性和炎症性皮肤病在观察一个特定疾病的发展变化和治疗后反应方共聚焦激光扫描显微镜观察正常皮肤医牛必须首先熟悉正常皮肤的影像学图像后才能对皮肤病的影像学图像资料 作出鉴别诊断。
与常规组织2图2.正常皮肤的纵向切片和横断面成像（HE染色和在体共聚焦扫描成像）Z 间的相关性在共聚焦扫描图像中，角化细胞为明亮的多边形（A2,箭头所指）, 大小为10-30gmo扫描深度为10-15pm处通常能看到颗粒细胞呈现为黑色椭圆 形的细胞核，周边环绕着呈颗粒状的细胞质，光度较强在角质层下20-100Mm 处可见位于棘层的角质形成细胞（C2,箭头所指）位于基底层的角质形成细胞 （D2,箭头所指）分布在真皮乳头周围（p, D）,注意其反射率高于棘层（ss,C2） 和颗粒层（sg,B2）的角质形成细胞可见到血管（箭头E）和胶原纤维束（箭头F） （Al, A2, Bl, Cl, DI, 40x/0.65 NA 的干物镜;B2, C2, D2, E, F, 30x/0.9 NA的浸水物镜；比例尺为25gm比例尺为25|im）o资料来源：Rajadhyaksha M,Gonzalez S, Zavislan J,et al.共聚焦激光扫扌苗显微镜用于人体皮肤在体成像II： 先进的仪器以及与传统病理学的比较J Invest Dermatol 1999; 113:293-303.Blackwell Science,Inc 授权转载。
面，RCM诊断技术有其独特的用途随着吋间的推移, 也可能会证实RCM会成为最实用的非创伤性诊断工具 银屑病是一种常见的炎症性皮肤病，患者通常接受各种各样的局部或系统治疗随着新的免疫调节治疗方法的不 3断出现，迫切需要一种客观公正的组织病理评价方法用RCM观察到的处于 稳定期的寻常型银屑病的典型特征与传统的组织病理学是一致的，包括角化不 全、Munro微脓疡、棘层肥厚、毛细血管扩张和真皮乳头丄延也可以用于病理 组织学检查之前确定皮损的边界范围急性接触性皮炎接触性皮炎是一种很常见的职业皮肤病然血TI前对其发病机制还不十分明 确，刺激性皮炎和变应性皮炎不易分辨，H前还不能进行明确的鉴别诊断，关于 刺激性接触性皮炎与肤色的关系，其敏感性差界程度的临床意义也不明确RCM 下可实时观察到接触性皮炎的典型特征，如海绵水肿，微泡形成，炎症浸润和表 皮坏死松解症（图3）RCM也可以明确区分急性刺激性接触皮炎和变应性接触 性皮炎我们已展示了用十二烷基硫酸钠进行斑贴试验所诱导的刺激性接触性皮 炎是以表皮浅层变化为特征其特征为角质层严重断裂，空隙形成，出现单个的 角化细胞和表皮炎症细胞浸润这些变化出现在斑贴试验后24h,而此时可能患 者还未出现临床症状。
经皮水分大量丢失也造成一些改变，提示这二种方法对于 皮肤的屏障功能提供了一种有效的评估方法也有研究提出刺激性接触性皮炎 与肤色关系中，其敏感性有差异，深色皮肤对刺激的耐受性比浅色皮肤强我们 用RCM进行一•项临床试验以验证这一•观点，对14名健康志愿者用不同剂量的 十二烷基硫酸钠作为刺激物进行斑贴试验观察发现刺激阈值呈剂量正相关性， 并且与肤色相关即使在未出现临床症状时，RCM检查就能显示皮肤组织发牛 的微观改变其特征变化如下：角化不全，海绵层水肿，微泡形成和血管周围炎 性细胞浸润.鉴别诊断其特征为单一形态的肿瘤细胞紧密聚集，显示拉长的细胞，沿其同 方向细胞核增大，呈线性排列（图4）在整个表皮层细胞都呈线性排列，缺乏 正常表皮细胞因逐渐分化后使得细胞大小形态不一的特征，真皮乳头结构缺失 此外，能观察到较为明显的浅表血管增牛扩张，扭曲变形，白细胞沿血管内皮呈 环形排列也可能观察到肿瘤细胞中有炎性细胞浸润在一个大样本的研究中评 估了 RCM准确诊断在体基底细胞癌的敏感性和特界性此项研究还观察了 RCM 作为一种无创性检查工具，用以监测一种新的免疫抑制剂■咪嗪莫特的疗效光化性角化病和鳞状细胞癌光化性角化病是角质形成细胞发育不良，可以发展为鳞状细胞癌。
能够鉴别这 二种疾病对于确定合理的治疗方案有极其重要的价值使用RCM检查能显示一 些光化性角化病的重要病理特征，如结构紊乱，角。