Notch在肝细胞癌中的表达及意义作者：任雪霞，徐正府，黄介飞，鄂群作者单位南通大 学附属医院消化内科，南通226001 ;2南通大学医学院病理解剖学教 研室【摘要】目的：探讨Notch 1-4在肝细胞癌中的表达特点及 其肿瘤生物学意义方法：采用免疫组织化学染色方法检测36例肝 细胞癌及其癌旁组织中的Notch 1 -4的表达结果：Notch 1 -4在肝细 胞癌中的表达分别为16例(44.44%)、11例(30.56%)、15例(41.67%)、 19例(52.78%),在癌旁组织中的表达分别为24例(66.67%)、17例 (47.22%)、22 例(61.11%)、27 例(75.00%)Notch 1 > Notch2 和 Notch4 在肝细胞癌中下调(PvO.05)结论：不同的Notch在肝细胞癌中的生 物学行为不尽相同，Notch! > Notch2和Notch4表达下调，可能具有 抑制肿瘤生长的作用关键词】肝细胞癌；Notch;免疫组织化学法;癌旁组织Notch expression in hepatocellular carcinoma and its oncological significanceIREN Xuexia, IXUZhengfu, 1 HUANG Jiefei, et al (1 Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001 ;2Pathological Department of Medical College, Nantong University)[Abstract] Objective: To study the expression of Notch 1 〜4 in hepatocellular carcinoma(HCC) and analyze its oncological significance. Methods: Immunohistochemical staining was used to measure Notch 1 〜4 in the carcinomatous tissues and pericarcinomatous tissues in 36 cases of HCC. Results: The expressions of Notch 1 〜4 in carcinomatous tissues were 44.44%( 16/36), 30.56%(ll/36), 41.67%(15/36), and 52.78%(19/36) respectively, but in the pericarcinomatous tissues they were 66.67%(24/36), 47.22%( 17/36), 61.l l%(22/36), and 75.00%(27/36) respectively. Notch 1, Notch2 and Notch4 were down-regulated in HCC(P<0.05). Conclusion: The different Notch has distinctly biological significance in HCC. The down-regulation of Notch 1, Notch2 and Notch4 may indicate that they can suppress the development and progression of HCC.[Key words] Hepatocellular carcinoma;Notch;Immunohistochemistory method;Pericarcinomatous tissueNotch是进化过程中高度保守的局部细胞信号结构，参与多 种细胞活动，决定细胞命运，在细胞分化、增殖、调亡等方面发挥重 要作用[1]。
Notch基因最初于1919年在果蝇体内被发现，Notch突变 可影响果蝇的翅膀、眼及刚毛的形成，共至在胚胎期造成致死性的神 经发育障碍Notch基因编码的跨膜受体是一个300 kD(p300)的单链 跨膜蛋白，在细胞膜形成一个由180kD(pl80)和120kD(pl20)多肽段 构成的异二聚体pl80包含大部分的胞外区，pl20则包含跨膜区和 胞内区，其胞外区和胞内区均高度保守当配体结合到胞外区，Notch 蛋白发生2次断裂释放Notch胞内区(ICN)进入细胞核发挥生物学 作用[2]OR前在脊椎动物中共发现了 4种Notch同源体，包括NotchK Notch2、Notch3和Notch4o近年来Notch信号途径成为发育生物学、 神经学、血液学及肿瘤学等许多领域的研究热点之一本研究采用免 疫组织化学S-P法联合检测Notch 1-4在肝细胞癌及对应的癌旁组织 中的表达，旨在探讨不同Notch在肝细胞癌中的表达和作用1材料与方法1.1材料(1)实验对象：2006年6月〜2008年1月南通大学 附属医院和南通市肿瘤医院手术切除的肝癌和对应的癌旁组织标本 36例，-80 C保存备用4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，4 M m厚连续切片。
术后肿瘤组织均病理证实为肝细胞癌;(2)主要试剂： 山羊抗人Notch 1多克隆抗体和兔抗人Notch3多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品;山羊抗人Notch2多克隆抗体和鼠抗人 Notch4单克隆抗体为R&D Systems公司产品;供疫组化检测试剂盒购 自上海晶美生物技术公司;多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术开发 公司;DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司1.2方法(1)载玻片处理：玻片经洗涤剂浸泡，自来水清洗 后泡酸过夜，再自来水中漂洗，蒸馅水冲洗，烤箱干燥后用稀释的多 聚-L-赖氨酸溶液包被，于室温下晾干备用;(2)染色步骤：石蜡切片常 规脱蜡至水，PBS冲洗抗原修复：在10 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0) 中加热沸腾切片1 min,随后沸点以下温水中浸9 min后PBS冲洗 1%过氧化氢孵育10 min,消除内源性过氧化物酶后PBS冲洗封闭 液室温下封闭1 h吸去封闭液分别加山羊抗人Notch 1多克隆抗体 (1 : 50)、兔抗人Notch3多克隆抗体(1 : 50)、山羊抗人Notch2多克 隆抗体(10 Mg/ml)和鼠抗人Notch4单克隆抗体(10 Mg/ml), 4 C冰 箱过夜。
加生物素标记的二抗至每张切片，室温下孵育30 min后PBS 冲洗DAB显色后苏木素复染梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封盖 玻片用已知阳性片作为阳性对照，用PBS替代第一抗体作为阴性 对照;(3)结果判断：参照邢传平等［3］的标准，先在200倍的显微镜下 随机观察5个视野，计算阳性细胞数的平均百分数作为该切片的阳性 细胞百分比进行分级，以四级分法，即阳性细胞数W25%为弱阳性(+), 26%〜50%为阳性(++), >50%为强阳性(+++),无阳性细胞为阴性(-)1.3统计学方法 全部数据均采用Stata7.0统计软件进行统 计分析配对等级资料用Wilcoxon配对秩和检验，检验水准A =0.05o2结果免疫组化染色方法观察Notch-1、2、3、4的表达光镜观 察可见，Notch 1-4蛋白主要分布在细胞浆中，胞浆阳性的细胞中有 少量细胞核和细胞膜着色，当出现核着色时，可被认为有核易位或活 化现象Notch 1-4蛋白的表达情况见表13讨论Nolch信号途径在参与胚胎发育、维持造血干细胞自我更新、 调控牙齿的正常形成等方面发挥重要作用在正常情况下，Notch信 号的功能是使多种不成熟细胞暂时维持在未分化状态，以调节细胞对 分化诱导因子的反应，并使未分化细胞保持一定的数量。
当Notch信 号异常地持续存在时，细胞不能正常分化而过度增殖，很可能就形成 肿瘤目前许多研究显示Notch在肿瘤的发生、生长过程中起重要作 用，其在肿瘤中的重要作用有：维护未分化状态;参与细胞命运的决 定;诱导终未分化，另外Notch还可通过调节肿瘤血管新生对肿瘤起 作用［4］人类许多肿瘤如宫颈癌、头颈肿瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、 恶性黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等均发现Notch信 号通路异常表达［5］但Notch与肿瘤的关系是复杂的，不同的Notch 受体在不同的肿瘤和肿瘤发展的不同阶段所起的作用是不同的在T 细胞白血病、乳腺癌、胶质细胞瘤，Notch是一个促癌基因［6-7］,而 在其他肿瘤如小细胞肺癌和肺腺癌细胞株中，Notch表现为肿瘤抑制 作用［8］另外，Notch在宫颈癌低恶性程度肿瘤中高表达，而在更具 有侵袭性高恶性程度的宫颈癌中则呈低表达Notch既具有促癌作用, 也具有抑癌作用［9］本实验采用免疫组化检测了 4种Notch受体在肝细胞癌及其 癌旁组织中的表达，Notch 1 -4在癌旁组织中阳性表达率均比癌组织 中局,4种Notch受体中Notch2无论在癌还是癌旁组织中表达率均最 低，但其同Notch 1和Notch4 一样，癌旁中表达阳性率高。
Notch3 在癌和癌旁组织中表达比较差异无统计学意义Gramantieri等［10］ 通过检测正常和肝硬化组织及肝癌组织中Notch受体(Notch!, 2, 3, 4)的mRNA和蛋白质表达水平发现与正常肝组织及硬化肝组织相 比，在所有20例肝癌样本中，Notch3、4被下调，在其中13例样 本中Notch! ~4都出现了下调作者认为这可能与细胞分化失调有 关本研究中NotchK Notch2和Notch4在肝细胞癌中出现卜调，说 明其具有抑制肝细胞癌生长的作用Notch的抑制作用可通过诱导 NF-kappaB的活性改变引起异常的有丝分裂，增加细胞在有丝分裂 GO和G1期，诱导细胞凋亡另外可增加细胞周期蛋白B1表达导致 肿瘤细胞死亡［11-12］Yao等［13］的研究也证实Notch 1在NF-kappaB 的参与下促进宫颈癌细胞周期停滞及细胞的凋亡但是Notch信号分 子对细胞凋亡的调节效应有时间依赖性和浓度依赖性［14］o另外， Notch!作为p53的靶基因在角质细胞癌细胞株中起到抑制肿瘤生长 的作用［15］o本文结果显示尽管同属一个家族，但Notch 1 >Notch2>Notch3 和Notch4在肝细胞癌中的生物学行为却不尽相同oNotch的信号转导 是一个即简单又复杂的过程。
其简单表现在：当Notch受体与配体结 合后，活化的Notch受体从胞膜脱落下来可直接转至核内，与转录调 节子结合而激活靶基因其复杂性表现在：多种Notch受体、配体共 同存在;激活Notch可以引发多条信号途径;许多胞外和胞内蛋白能通 过不同的机制调节Notch信号;Notch受体的表达水平影响了 Notch信 号的效应［16］o在不同的肿瘤和肿瘤发展的不同过程中，Notch信号 途径有不同的作用，其可能的原因有：(l)Notch广泛存在于许多组织 细胞中，不同的刺激信号都能激活Notch通路，Notch信号通路具有” 共享性n；(2)Notch通路的受体、配体和靶基因有不同的类型，在不同 的组织或肿瘤发展的不同阶段，相同Notch受体的作用也可能是不同 的;(3)细胞内其他信号通路，如Ras、Wnt-1等也可通过激活Notch途 径调控细胞的生长[17]本实验通过4种Notch受体在肝细胞癌和癌 旁组织中的比较研究，为进一步探讨Notch与肝细胞癌的关系提供理 论依据参考文献】[1J Bol?s V, Grego-Bessa J, de la Pompa JL. Notc。