生物样品定量分析指导原则 与实验实施2015.6.30方法学确证是整个药代动力学研究的基础所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究建立了测定方法，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性生物样品中药物定量分析CFDA关于相关生物样品定量分析的要求化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则9012 生物样品定量分析方法验证指导原则生物样品中药物的定量分析2005年陆续陆续 在 相关研究中颁颁布《中国药药典》 2015年版四部国外相关指导原则FDA：Guidance for Industry Bioanalytical Method ValidationEMEA：Guideline on bioanalytical method validation生物样品中药物的定量分析2013年修订订版本2012年版本CFDA一、指导原则解读1. 范围围2. 生物分析方法验证验证2.1 分析方法的完整验证验证2.1.1 选择选择 性2.1.2 残留2.1.3 定量下限2.1.4 标标准曲线线2.1.5 准确度2.1.6 精密度2.1.7 稀释释可靠性2.1.8 基质质效应应2.1.9 稳稳定性2.2 部分验证验证2.3 交叉验证验证3. 试验样试验样 品分析3.1 分析批3.2 分析批的接受标标准3.3 校正范围围3.4 试验样试验样 品的重新分析和报报告值选择值选择3.5 完整性3.6 用于评评价方法重现现性的试验样试验样 品再分析EMEA一、 指导原则解读2.1.1 选择选择 性2.1.2 残留2.1.3 定量下限2.1.4 标标准曲线线2.1.5 准确度2.1.6 精密度2.1.7 稀释释可靠性2.1.8 基质质效应应2.1.9 稳稳定性FDA一、指导原则解读1. 范围测定对象确定——生物基质中的药物浓度。
适合于非临床或临床试验样品实际分析的基本要求规定部分验证或交叉验证的适用范围一、指导原则解读2.1 完整验证每个物种和每种基质进行完整验证难以获得相同基质，可以采用适当基质替代并给出理由完整验证包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围、准确度、精密度、基质效应、分析物的稳定性2. 生物分析方法验证对照标准物质对照标准物质的溶液+空白生物基质=校正标样色谱法需要使用内标对照标准物质需要提供： 分析证书、储存条件、失效日期、批号内标： 证明可适用，即无干扰2. 生物分析方法验证质谱质谱 分析推荐使用同位素内标标区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分（代谢产物或共同服用的其他药物）6个不同来源的空白基质分别分析如有干扰，则干扰的峰面积小于LLOQ的峰面积的20%，小于内标峰面积的5%，可以接受2.1.1 选择性在新药研究中需要按照要求在报告上提供相应数 量的典型色谱图J. Wen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43 (2007) 655–658如果待测组分是内源性成分？Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 1151–1159样品处理用的水及流动相中不含有I空白生物样品中的I属 于内源性物质空白生物样品标准添 加I依旧可以测定n如果待测组分是内源性成分？添加LLOQ浓度添加MQC浓度实测样品1. 证明处理溶剂（包括流动相）中 未有需要测定的成分2. 证明内源性成分存在测定成分3. LLOQ添加图谱显示添加测定成 分后，峰面积增加，并辅以数据说 明（标准曲线）Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 1151–1159如果存在外源性非测定成分影响？（例如中西药合并给药 ）C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 48–56空白血浆苯丙胺盐酸伪麻黄碱苯海拉明空白血浆+生姜提取物充分考察同时给药的成分是否会影响待测成分的专一检测C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 48–560.5ng/ml1.0ng/ml4.10 ng/ml14.05 ng/ml空白血浆+标准样品给药速效抗晕胶囊后24h血样浓度前一针进样的残留对后一针进样的干扰。
一般多发生在高浓度进样后先进一针工作曲线的最高浓度，再紧接着进一针空白，观察是否有干扰，干扰峰面积小于LLOQ的峰面积的20%，小于内标峰面积的5%，可以接受如干扰，需要消除2.1.2 残留犬血浆中的盐酸克伦特罗的测定A.空白样品； B.B. 0.1 ng/ml标准 血浆； C.进样10 ng/ml标 准血浆样品后进 样的空白样品 残留洗针的溶剂、次数；提取溶剂；复溶比例等重新优化能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度是标准曲线的最低点应该满足预期的浓度与实验目的准确度应在标示值的+/-20%范围内变异系数不得超过20%2.1.3 定量下限指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度制备各个浓度的校正标样——基质相同每个分析批都应该有一条标准曲线6个校正浓度水平+空白样品+零浓度样品（空白+内标）验证中需要评价3条标准曲线回算浓度应该在标示值的+/-15%，LLOQ+/-20%之内回算浓度偏差=【（实测值－标示值）/标示值】X100%2.1.4 标准曲线绘制工作曲线评价干扰当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。
即低浓度点满足回算的要求2.1.4 标准曲线权重浓度峰面积比11/x1/x2100.102139.7 117.7 103.6 200.139112.9 102.3 97.6 500.24192.6 88.7 89.5 1000.44393.3 91.7 94.8 2000.86295.3 95.0 99.2 5002.284104.3 104.7 110.1 10004.30999.2 99.8 105.2 INTERCEPT0.04190.051780.06014SLOPE0.0043010.0042650.00404R20.99910.99910.9942准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度校正标样——绘制工作曲线质控样品——评估准确度用4个浓度评价◦ 定量下限 ◦ 低浓度QC～～LLOQ的3倍以内 ◦ 中浓度QC～～标准曲线中间浓度 ◦ 高浓度QC～～标准曲线上限的75%2.1.5 准确度二者需要分别别配制，即储备储备 液不相同+/-20%+/-15%批内准确度：1个分析批进行验证，每个浓度至少5个样品批间准确度：3个分析批进行验证，且至少进行两天，每个浓度至少5个样品。
2.1.5 准确度分析物重复测定的接近程度测量值的相对标准偏差（变异系数）采用与准确度验证相同的分析批结果进行计算4个浓度验证定量下限变异系数不超过20%其余浓度点不超过15%2.1.6 精密度判断样品稀释后是否会影响定量的准确度和精密度配制高于定量上限浓度的样品用空白基质稀释该样品每个稀释因子至少测定5个数据，其准确度和精密度应在+/-15%之内2.1.7 稀释可靠性质谱方法应该考察基质效应采用至少6批来自不同供体的基质，不可以合并基质选择高、低两个质控浓度进行求算不同浓度的基质因子计算内标归一化基质因子=分析物基质因子/内标基质因子变异系数<15%2.1.8 基质效应空白血浆沉淀蛋白＋标准溶液浓度C纯净溶液浓度CQC血浆沉淀蛋白浓度CSet 1Set 2Set 3最终进样检测浓度相同基质因子＝ ×100%Set 2Set 1基质因子的计算J. Wen et al. / J. J. Wen et al. / J. ChromatogrChromatogr. B 867 (2008) 153–159. B 867 (2008) 153–159选择结构类似的化 合物为内标可以很 好的消除基质效应 的影响，应用峰面 积比值进行定量， 其基质效应约为 100%分析物基质因子内标基质因子内标归一化基质因子选择低浓度和高浓度质控样品进行验证。
预处理后或者在相应条件储存后立即分析得到该条件下数据制备随行标准曲线，求算上述质控样品的浓度，与标示浓度比较，均值应与标示浓度的偏差在+/-15%之内不是比较色谱峰面积】2.1.9 稳定性稳定性的考察时间尺度应该不小于试验样品的储存时间及相应条件下的处理方式或时间分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性基质中分析物冷冻和融化稳定性基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性储存前预处理的基质中分析物的稳定性2.1.9 稳定性储备液稳定性：4度冰箱或者-20度冰箱长期冷冻稳定性：-20度或者-80度冰箱冻融稳定性：3个冻融循环（冷冻8h以上）自动进样器稳定性：预处理后放置自动进样器上，时间长短与分析批有关室温稳定性：室温放置的稳定性，与前处理一个分析批有关采血后全血稳定性：与药物是否易降解有关2.1.9 稳定性分析方法的转移仪器的改变校正浓度范围的改变样品体积的改变改变基质或者物种改变抗凝剂改变样品处理步骤改变储存条件2.2 部分验证CFDA：并未给给出如何部分验证验证，究竟应该选择应该选择 哪些部分验证验证，因此需要自行判断并说说明理由。
EMEA：部分验证验证 可以少到测测定批间间精密度和准确度，也可以至几乎全部验证验证 内容应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证同一份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评价均值的差异质控样品：+/-15%以内试验样品：+/-20%以内2.3 交叉验证3.1 分析批空白样品零浓度样品校正标样——至少6个（与验证相同）质控样品——低、中、高3个浓度，各2份（不少于试验样品总数的5%）-分散处理试验样品3. 试验样品分析校正标样：◦ 回算浓度偏差在标示值的+/-15%以内◦ 定量下限+/-20%以内◦ 不少于6个标样符合上述要求校正标样越多，需要75%的标样符合质控样品：◦ 准确度+/-15%以内◦ 67%的质控样品符合◦ 不符合的应该不在同一个浓度水平如不符合，重新测试3.2 分析批的接受标准试验样品分析浓度范围比验证时候工作曲线窄◦ 调整标准曲线范围和质控样品浓度◦ 或者加入新的质控样品浓度试验样品分析浓度高于定量上限◦ 延伸标准曲线范围，增加额外浓度的质控样品◦ 或者改变试验样品浓度（稀释）至少应该有2个质控样品浓度落在试验样品的浓度范围内改变标准曲线，需要重新进行方法学验证（部分验证）3.3 校正范围事先制定SOP确定重新分析的理由和选择报告值的标准，并在报告中提供重新分析的样品数目及比例。
主要理由：◦ 校正标样或质控样品不合格◦ 内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著◦ 仪器功能异常或者进样不当◦ 高于定量上限或者低于定量下限◦ 空白或安慰剂样品中测到分析物◦ 色谱图难看3.4试验样品重新分析和报告值选择不接受由于药药 动动学行为为不佳 而重新分析的 理由在SOP中应该对色谱的积分和重新积分进行规定任何偏移SOP的色谱积分都应该在报告中。