一. 重组质粒的构建 T质粒载体重组的DNA分子是在 DNA连接酶的作用下，有 Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA分子进行连接DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌 DNA连接酶两种 DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA分子连在一起的功能，而且 T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌 DNA连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双链 DNA分子连接起来但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加 DNA浓度来提高平末端的连接效率 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为 3步：首先，T4 DNA连接酶与辅因子 ATP形成酶-ATP复合物；然 后，酶-ATP复合物再结合到具有 5'磷酸基和 3'羟基切口的 DNA上,使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口圭寸起来连接反应通常将两个不同大小的片断 相连很多DNA聚合酶在进行 PCR扩增时会在 PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一 个突出的碱基 ApUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的 3'端带有一个突出的 T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和 PCR产物的两端进行正确的 AT配对，在连接酶的催化下，就可以把 PCR产物连接到 pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体连接反应的温度在 37 C时有利于连接酶的活性 但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的因此采取折中的温度，即 12-16 C,连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定二. 感受态制备原理细菌在0° C CaCb低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易 吸收外源DNA的感受态三. 3半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码 3 —半乳糖核苷酶半乳糖核苷酶是由 4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解•用 X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色现在一些特定的质粒（比如 pUC/pBS等），常带有 3 —半乳糖核苷酶的调控序列和3 —半乳糖核苷酶 N端146个氨基酸（a肽段）的编码序列，在这个编码序列里还 插入一个多克隆位点（ MCS ,它并不影响lacZ的表达另外，常用的大肠杆菌带有3 —半乳糖核苷酶 C端部分序列（3肽段），的编码序列。
在各自独立的情况下，这 些质粒与大肠杆菌各自编码的 3 —半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性 只有当携带 a肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物 IPTG的诱导下，载体质粒能够合成3 —半乳糖核苷酶 N端（a肽段），这样就与宿主细胞合成的 3 —半乳糖核苷酶C端部分序列（3肽段）互补，形成完整的 3 —半乳糖核苷酶活性蛋白而当外源基因插入到此种载体质粒 lacZ的多克隆位点后， 会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成 3 —半乳糖核苷酶；而对于空载体， lacZ基因正常表达，通过 a互补合成3 —半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物 X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑实验准备： 清洗，5个100ml锥形瓶（外加 1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶， 接种环，涂布棒准备100ml超纯水溶液：LB300ml（液体50ml+50ml ,固体100ml）,0.1mol/L CaCI2 10ml , 100mg/mlAmp 1 ml , 20mg/mlX-gal 1 ml , 200mg/ml IPTG 1 ml大肠杆菌菌液 1ml感受态细胞连接产物4管4 x 5 = 20ul 做 4 份目的基因T载体T4连接酶10x冲液4 x 4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL灭菌：5个100ml锥形瓶（外加 1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种 环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具 2畐副, , 0.1mol/L CaCl2实际配置 20mg/ml X-gal X-gal 为5-溴-4-氯-3-吲哚-3 -D半乳糖苷。
用二基甲酰 胺（DMF溶解 X-gal配制成的 20mg/ml （取0.02gX-gal ，用DMF定容为1ml）的贮存 液保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于 -20 CX-gal溶液无须过滤除菌 DMF二甲基甲酰胺；Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide; DMF; CAS: 68-12-2 理化性质：无色、淡的胺味的液体分子式 C3-H7-N-O分子量 73.10相对密度 0.9445（25 C ）熔点 -61 C沸点 152.8 Co） 溶于 DMS O溶解度可达 20mg/ml也溶于 DMF溶于 DMSO 溶解度可达 20mg/ml也溶于 DMF200mg/ml IPTG在0.8ml蒸馏水中溶解 0.2g IPTG后，用蒸馏水定容至 1ml，用0.22卩m滤器过滤除菌，贮存于 -20 CoLB培养基：配制每升培养基，应该在950 ml去离子水中加入：胰化蛋白胨 10g酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解 .用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌 20min. （ 100mlLB培养基加入 1.5g琼脂粉为固体培养基）0.1mol/LCaCl2 :取0.11098g 氯化钙固体定容至 10mlAmp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定 容至1ml，用0.22卩m滤膜过滤除菌.实验过程（一）.目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头， 面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂T载体，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌 操作步骤PCR产物与T载体直接连接：（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1.5ml微量离心管，双dd Water 14~16 ° Co（2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml目的基因1ml T 载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/UI ）; 1ml连接酶缓冲液buffer ; 3.5 ml dd Water ，总量 10ml 体系3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 水中）中保温过夜（12-16h ）o14 ° C干式恒温仪（或10 x14 ° C4 C冰箱备用4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置（二）.大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头， 50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计， 超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培 养皿（已铺好固体 LB-Amp）,酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过 滤器试剂：E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCI2溶液，无菌dd Water ， LB培养基 （不加抗菌素）， LB培养基（加抗菌素），无菌 dd water，IPTG， X-gal o步骤（1） 在超净工作台中，将 1ml大肠杆菌菌液加入 100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37 C摇床培养过夜。
2） 取0.5ml上述菌液转接到含有 50mL LB培养基的三角烧瓶中， 37C下250r/min 摇床培养 2~3h，测定 OD590 为 0.35~0.4 左右（<0.4~0.6，细胞数 <108/mL， 此为关键参数！）注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的 LB培养液同时摇菌）（3） 将1ml菌液加入到 4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于 4C，5000rpm 离心 5min4) 将离心管倒置以倒尽上清液，加入 1ml冰冷的0.1 mol/L CaCI2 溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置 30min5) 4 C, 5000rpm 离心5min，弃上清液后，用 100卩L冰冷的 0.1 mol/L CaCI2溶液垂悬，插入冰中放置 2h，可以直接用作转化实验，或立即放入 -4摄氏度冰柜中保藏6) 事先将恒温水浴的温度调到 42 Co(7) 从-70 C 超低温冰柜中取出一管( 100卩L)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴 5~10min8) 加入5卩L连接好的质粒混合液( DNA含量不超过 100ng )，轻轻震荡后放 置冰上20min。
9) 轻轻摇匀后插入 42 C水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min10) 在超净工作台中向上述各管中分别加入 300卩L LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37 C震荡1h11) 在超净工作台中取上述转化混合液 200卩L,分别滴到含合适抗菌素( Amp100ug/L )的固体 LB平板培养皿中，再在平板上滴加 40卩L 20mg/ml X-gal , 7卩L200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使 细胞破裂，影响转化率12) 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37 C恒温培养箱中 30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37 C恒温培养箱过夜13) 在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇，擦干桌面14) 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好注意白色菌斑三) •转化克隆的筛选和鉴定器材 旋涡混合器， 小镊子，微量移液取样器， 移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，超净工作台， 酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂」LB培养基(加抗菌素)， PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液， 65%甘油(65%甘油，0.1mol/L MgSO4, 0.025mol/L TrisCl pH8.0 )操作步骤 方法一：快速PCR筛选法(1) 在转化的平板培养基上随机选取 4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号2 )在0.2ml PCR 微量离心管中配制 25卩l反应体系dd water 16 卩 l10 x PCR buffer (不含 MgCI2) 2.5 卩 l25mM MgCl2 1.5 卩2.5mmol/L dNTP 2(每种 dNTP终浓度0.2mM)l ( 12.5 — 25pmoles )l ( 12.5 — 25pmoles )头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入10mol/L Primerl 110mol/L primer2 1PCR混合液中洗一洗模板质粒用小tipTaq 酶 0.5 i l (1.5u )总体积25 i l(2) 根据厂商的操作手册设置 PCR仪的循环程序 (本实验室已经设。