1青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究作者：王昌明，张孝飞，黄岚珍，范才文，林云，徐青【摘要 】 目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系 HFL-I细胞株体外生长的影响，为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据方法采用 CCK-8 法检测青蒿琥酯对体外培养的 HFL-I 细胞的生长抑制作用，用流式细胞术测定细胞凋亡率; RT-PCR 法测定 Bcl-2 mRNA和 Bax mRNA 表达结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制 HFL-I 细胞增殖，HFL-I 细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P<0.01)，Bcl-2 mRNA 的表达显著低于对照组，Bax mRNA 的表达显著高于对照组结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调 Bcl-2 mRNA 和上调 Bax mRNA 表达抑制 HFL-I 细胞增殖，促进 HFL-I细胞凋亡 【关键词】 青蒿琥酯 ; 人胚肺成纤维细胞 ; 增殖; 凋亡; Bax; Bcl-2肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎性间质性肺疾病，患者平均生存时间一般不超过 3 年，目前尚无有效治疗方法近年研究发现，青蒿素类药物除可抗疟疾外，亦具有抗肿瘤、抗感染及抗纤2维化等作用。
2009-06 ～2009-11 ，我们观察了青蒿素衍生物青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast，HELF) 系 HFL-I 细胞增殖、凋亡的影响及机制，旨在为临床治疗肺纤维化提供理论依据1 材料HFL-I 细胞株( 中国科学院细胞库提供)，青蒿琥酯(分析纯，纯度>99% ，广西桂林南药公司产品，批号 ZA080203)，CCK-8 试剂，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)，D-MEM/F-12 培养基，FBS ，胰酶;RNA 提取试剂 Trizol，反转录试剂盒 PrimeScript TMRT reagent Kit，PCR 试剂盒 Premix PrimeSTAR HS，引物由上海生物工程有限公司合成2 方法2.1 HFL-I 细胞培养取 HFL-I 细胞株，用含 10% FBS、 1×105U/L 青霉素及 100 mg/L 链霉素的 D-MEM/F-12 培养液培养，37℃、5% CO2 培养箱培养，3 d 换液 1 次，5～6d 传代1 次取 4 代以上细胞用于下列实验2.2 细胞增殖及细胞增殖抑制实验采用 CCK-8 法。
取对数生3长期 HFL-I 细胞接种于 96 孔培养板中，每孔 10 000 个，12 h 后分别加入浓度分别为 2.5，5，10，20，40，80 mg/L 的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设 3 个复孔， 37℃、5%CO2 饱和湿度下培养 48 h，期间吸去培养液，PBS 洗涤 1 次，加入含 10% CCK-8 溶液 100 μl 的无血清培养基，继续培养 2 h 后于 450 nm处测定吸光度(A 值)，并计算各组细胞抑制率细胞抑制率(%)计算公式：[(1 - 实验组 A 值/ 对照组 A 值) ×100 %]2.3 细胞凋亡形态学观察 HFL-I 细胞调整浓度为 1×106/ml种于 6 cm 皿中，待细胞完全贴壁后，经 10 mg/L 青蒿琥酯作用48h，进行 Hochst33258 染色，于荧光纤维镜下观察并摄像2.4 流式细胞数术检测细胞凋亡率 取对数生长期 HFL-I 细胞，用含 10% FBS 的 D-MEM/F-12 培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于 25 cm2 的培养瓶中，5% CO2、37℃培养箱中培养 12 h 至贴壁，用含 0.5% FBS 的 D-MEM/F-12 培养液培养24 h，使细胞周期同步化。
加入浓度分别为 1，10 ，100 mg/L 的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设 3 个复孔，作用 48 h 后收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存 (有效期为 1 周)检测前用 PBS 洗去固定液，加入 20 μl RnaseA， 37℃ 孵育 30 min，暗处加 PI 染液，冰浴 30 min，染色后以 300 目筛网过滤调整细胞浓度为 1×105～6/ml 后采用流4式细胞仪，在波长 488 nm 下用 Multicycle DNA 分析软件行凋亡率测定，实验重复 3 次2.5 RT-PCR 检测 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA 的表达 HFL-I细胞种于 6 孔板，细胞贴壁并长至 80%丰度，换含 2%血清培养基(D-MEM/F-12)培养 12 h，后加入不同浓度的青蒿琥酯(1，10，100 mg/L)，设不加药物的阴性对照组，继续培养 24 h 后，用 Trizol 试剂提取高质量的 mRNA按照反转录试剂盒说明合成cDNAPCR 引物序列如下：人内参 β-actin：上游引物 5’-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3’，下游引物：5’-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3’，扩增长度 300bp， Bax 上游引物：5’-ATTGGAGATGAACTGGACAA-3’ ，下游引物：5’-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3’，扩增长度 454bp，Bcl-2 上游引物：5’- CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3’，下游 5’-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3’，扩增长度 198bp。
2.6 统计学方法采用 SPSS10.0 软件进行统计学处理，计量数据用±s 表示，行 t 检验，P≤0.05 表示差异有统计学意义3 结果3.1 青蒿琥酯对 HFL-I 细胞株增殖的抑制作用 HFL-I 细胞在5给予 2.5～160 mg/L 的青蒿琥酯 48 h 后，生长受到显著抑制，并呈剂量依赖性(见图 1)测定青蒿琥酯对 HFL-I 细胞的 IC50 为 10 mg/L图 1 不同浓度青蒿琥酯对 HFL-I 细胞 48 h 增殖的影响3.2 青蒿琥酯对 HFL-I 细胞株凋亡的形态学观察经Hochst33258 染色对照组中无凋亡细胞，青蒿琥酯组(10 mg/L)可见多个凋亡细胞，核碎裂且呈数个亮蓝色荧光颗粒见图 2 A-对照组 B-青蒿虎酯 10 mg/L 图 2 凋亡染色结果(Hochst33258，200×)3.3 青蒿琥酯对 HFL-I 细胞株凋亡率青蒿琥酯各浓度组(1，10，100 mg/L)的细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(见表 1)表 1 不同浓度青蒿琥酯对体外培养的 HFL-I 细胞凋亡率的影响3.4 青蒿琥酯对 HFL-I 细胞株 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA表达的影响与对照组比较随着青蒿琥酯浓度的增大，Bcl-2 mRNA越来越弱，而 Bax mRNA 表达越来越强( 见图 3～4)。
1. 对照组 2.青蒿虎酯 1 mg/L3.青蒿虎酯 10 mg/L 4.青蒿虎酯 100 mg/L 图 3 青蒿琥酯对 图 4 青蒿琥酯对 HFL-I 细胞 Bcl-2 mRNA HFL-I 细胞Bax mRNA 表达的影响 表达的影响4 讨论6肺纤维化的发生涉及到诸多因素，而成纤维细胞增生或凋亡不足是肺纤维化形成机制中重要的环节，肺内 ECM 主要由成纤维细胞产生，正常时成纤维细胞处于静息状态，活化时大量增殖，分泌细胞因子，转变为肌成纤维细胞故成纤维细胞的活化是肺纤维化形成的关键步骤及核心环节[1]因此，抑制肺纤维细胞过度增生和促进其凋亡成为防治肺纤维化的一种有效手段青蒿素是 1972 年我国科研人员首次从菊科植物黄花蒿中分离得到抗疟疾的有效单体，其衍生物包括二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有过氧桥结构，属于新型倍半萜内酯化合物除青蒿琥酯在碱性条件下可溶外，其他青蒿素衍生物均难溶于水[2]目前，青蒿素类药物因毒性低、抗疟疾作用强已被 WTO 批准为在世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物近年研究显示，青蒿素类药物尚有多种其他药理作用徐光兰等[3]研究发现青蒿琥酯可降低肺纤维化大鼠 TGF-β1、TNF-α 的表达，明显减轻肺纤维化程度。
本实验亦证实了青蒿琥酯可以抑制人胚肺成纤维细胞增殖、促进其凋亡细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，它是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除富余、衰老或受伤的细胞，以保持机体内环境平衡的一种自我调节7机制[4]细胞凋亡是一系列基因活动引起的级联反应的结果，在这些基因中，Bcl-2 家族与细胞凋亡关系最密切，有关研究较为深入[5，6] Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2 家族成员是细胞凋亡过程中的一类调节因子，该基因家族包含两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因如 Bcl-2 基因，另一类为包含 Bax 等基因在内的促进细胞凋亡的基因，Bcl-2 和 Bax 通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当 Bax 形成同源二聚体时诱导细胞凋亡 ;与 Bcl-2 形成异源二聚体时则实现了 Bcl-2 抑制细胞凋亡的功能[7]在体内， Bcl-2 与 Bax 相互影响， 相互拮抗， 其作用并不直接表现为单独的 Bcl-2 和 bax 对凋亡的影响， 而是由 Bcl-2/bax 来决定细胞是否发生凋亡[8，9]本研究显示，实验组 Bcl-2 mRNA 表达均显著低于对照组，且有逐渐减弱的趋势。
提示青蒿琥酯能抑制 Bcl-2 mRNA 在 HFL-I细胞中的表达，且呈剂量依赖性，而 Bax mRNA 刚好相反，此可能为其诱导细胞凋亡、对抗肺纤维化的的机制之一参考文献】[1] Gabbinani G.The biology of the myofibroblast[J].Kidney Int，1992，41(3):530.[2] Li Y，Wu YL. An over four millennium story behind 8qinghaosu(artemisinin)-a fantastic antimalarial drug from a traditional Chinese herb[J]. CurrMed Chem，2003，10(21)：2197.[3] 许光兰，陈 平，梁劲松，等.青蒿琥酯对实验性肺纤维化大鼠治疗作用及其机理研究[J].临床医学工程，2009，16(9) ：6.[4] MajnoG，Jotis I.Apoptosis，oncosis and necrosis:anoverview of Cell death[J].AmJPathol，1995，146(2):3.[5] 汪坚敏，吴 莘，张春炳，等.葛根素对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及 Bcl-2、 Bax 表达的影响 [J]. 实用医学杂志， 2008，24(2)：186.[6] Vassiliki D， Malamou-Mitsib， Lampros K， et al. Apoptosis bcl-2 and nitrotyrosine expression in an angioplasty-restenosis rabbit： An experimental model [J]. Int J Surg， 2007，5(4)：260.[7] Lalier L， Cartron PF， Juin P， et al . Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis [J ]. 9Apoptosis， 2007， 12 ( 5 ) :8872，896.[8] Panasiuk A，Dzieciol J， Panasiuk B，et al. Expression of p53， Bax and Bcl-2。