实验三 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定 【实验原理】 叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包 括叶绿素 a（蓝绿色）和叶绿素 b（黄绿色） ，后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色） ，它 们 与类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可 用丙酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取叶绿体色素的分离有多种方法，本实验仅介 绍纸层析法层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动 着试样经过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固 定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相 间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的 各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同， 以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子 向四周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色 的环将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，这 种 现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光 能后处于激 发状 态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量 以辐射能的形式发射出红光量子叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、高温等的破 坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定叶绿素中的 镁可以被 H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜 （Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比 原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏 【材料、 设备 与试剂】1. 材 料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片2.设 备 电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆 形滤纸、小漏斗等3.试 剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L 盐酸、醋酸铜粉末、 碳酸钙等 【方法与步骤】1. 叶绿体色素的提取 1.1 取菠菜或其他植物新鲜叶片 5?g，洗净，擦 干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中1.2 在研钵中加入少量碳酸钙和约 3-5?mL 丙酮后， 研磨成匀浆，研磨过程中根据情况加入一定量的丙酮以利于研磨，匀浆用多层纱布过滤到 试管中。
1.3 在残渣中再加入 3~5?mL 丙酮，研磨过滤，共得深绿色溶液近 10?mL，其中 含有叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质2. 叶绿体色素的 分离 2.1 纸层析分离法纸层析装置如图 8.1 所示具体操作为：2.1.1 先用滤 纸条 （2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径 11?cm，略大于培养皿直径） ，在其中心位置钻一个纸芯粗度 的圆形小孔（滤纸不能折叠） ，将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分， 使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约 1.5?cm（与培养皿盖高度同） 2.1.3 把这 个 带纸 芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液， 小心地滴入纸芯上端 7-10 滴注意：一定要在色素斑点稍风干后，再滴入另一滴，而且 液滴不能污染滤纸2.1.4 向培养皿中倒入适量（约为培养皿高度的 1/3 左右）四氯化碳， 并加入一勺（适量）的无水硫酸钠，使纸芯下端浸入其中，并立即盖上培养皿此时，推 动剂借毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，数分钟后，就 可见到滤纸上出现四或五个颜色不同的同心环，并逐渐扩大。
2.1.5 当推动剂前沿接近滤纸 边缘时（约 30?min 左右） ，取出滤纸，即可看到分离的各种色素，用 铅笔 标出各种色素 的位置和名称，并绘简图示之或拍摄图片3. 叶绿体色素的理化性质 3.1 荧光现象观察叶 片丙酮提取液（稀释前的浓提取液）在反射光和透射光下的颜色有何不同并拍摄图片叶 绿体色素溶液在反射光下呈樱桃红色，在透射光下呈绿色，说明原因3.2 光对叶绿素的 破坏作用取叶绿体色素提取液少许，分装于 2 支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸遮光） ；另一支放在强光下（阳光直射） ，经 0.5~1?h 后，观察 2 支试管中溶液颜色有何不同并 拍摄图片3.3 氢和铜对叶绿素中镁的取代作用 3.3.1 取 2 个试管，A 管中加入稀释后的 叶绿体色素提取液 2?mL，作为对照；在 B 管中加入稀释后的叶绿体色素提取液 5?mL 并 加入 1~2 具体操作为：2.1.1 先用滤 纸条 （2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸 芯2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径 11?cm，略大于培养皿直径） ，在其中心位置钻一个 纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠） ，将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端 多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约 1.5?cm（与培养皿盖高度同） 。
2.1.3 把 这 个 带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的 丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端滴浓盐酸，摇 匀，溶液变为褐色，拍摄图片，此时叶 绿素中的镁（Mg2＋）被氢（H＋）取代而生成了去镁叶绿素3.3.2 从 B 管中分出一半 装人 C 管，作为对照，在 B 管余下的溶液中加入一小粒醋酸铜结晶，将 B 管和 C 管都 在酒精灯上慢慢加热，则 B 管中的溶液又转变在蓝绿色，拍摄图片，这是因为其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素以叶绿素 a 为例，反应过程如下：【注意事项】 （1）研磨叶片要充分，否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显 （2）纸层析时，纸芯一定要卷实，分离色素用的圆形滤纸在中心打的小圆孔周围必须整齐， 否则分离的色素不是一个同心圆 （3）色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行， 以防止光破坏色素，影响实验结果 （4）实验用的有机溶剂较多，且都易挥发，取时动作 要快、取后要随时加盖3.3 氢和铜对叶绿素中镁的取代作用 3.3.1 取 2 个试管，A 管中 加入稀释后的叶绿体色素提取液 2?mL，作为对照；在 B 管中加入稀释后的叶绿体色素提 取液 5?mL 并加入 1~2 【思考题】 （1）图示叶绿体色素纸层析结果，用 铅 笔分别标出叶绿素 a 和叶绿素 b、叶 黄素、胡萝卜素。
（2）研磨提取叶绿体色素时加入 CaCO3 和石英砂各有什么作用？（3） 根据 Cu2＋在叶绿素分子中的替代作用，对制作绿色标本有何指导意义？ 【 作业】 请 写出电子版实验报告并上传至老师邮箱（需附图片；需回答上述 3 个问题） （由任 课教 师李仲芳摘编，仅供参考）。