ALK的病理学和诊断指南,返回目录,FISH –ALK 检测的现行标准,阳性结果,标准：分开的红/绿信号,非典型：单个红点,非典型：分开 + 单个红点,ALK 阳性的定义: ≥15% 的细胞呈阳性,Varella-Garcia et al., ASCO 2010; Abs #10533,FISH –ALK检测的现行标准,阴性结果1,标准：融合信号,非典型：单个绿点,1. Varella-Garcia et al., ASCO 2010; Abs #10533,FISH检测样本的制备及染色概述,肿瘤区域的确定 对一玻片进行H&E染色 标出肿瘤区域（不包括坏死区域、原位癌和小细胞癌） 用标记好的H&E染色玻片作为模板，在未染色玻片上标注肿瘤区域* (后续步骤参见未染色玻片),FFPE样本的制备 从组织块上切下≥ 2段，厚度5±1μm 置于表面带正电荷的载玻片上,去石蜡预处理蛋白酶处理,与探针杂交,清洗 (杂交当日),DAPI复染,准备好玻片自以下步骤开始,*FISH法中应使用来自H&E染色的连续10片内的切片,Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit Package Insert,ALK FISH信号解读指南,典型的信号形式,阴性信号：邻近或融合的橙色和绿色,阳性信号：分开或绿色丢失,Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit Package Insert,EML4-ALK的FISH检测中需注意的问题,至少计数50个肿瘤细胞以确保结果的精确性 1 如果红色和绿色探针分离 2个信号直径 ，则认为FISH信号为阳性1 ALK 重排可能遍及整个肿瘤而非局部2 约5%-11%的细胞会出现假阳性分离1,2 ALK重排细胞比例的增加与克唑替尼治疗的肿瘤缓解程度并无关联3,Varella Garcia et al., IASLC 2011; Abs #MTE36.1 2. Camidge et al., Clin Cancer Res 2010; 16:5581-5590 3. Camidge, IASLC 2011; Abs #MO04.04,FISH病理报告实例：显示 EML4-ALK 融合,,,Courtesy I. Wistuba,FISH病理报告实例：显示无EML4-ALK 融合,病理报告要使用准确的语言，如 “EML4-ALK 重排 15%” “ALK 异常” 还包括其他变异，如ALK基因拷贝数增加，此变异未被确认为对ALK抑制剂应答的预测性标记物1,Courtesy I. Wistuba 1. Raftopoulos et al., IASLC 2011, Abs #O05.06,免疫组织化学(IHC) 检测ALK表达,使用高敏感度检测系统后，越来越多的数据支持IHC可用作初步筛查的方法 敏感度和特异度可达100%，尽管在不同研究中存在差异 与FISH相比，IHC是一种更常规的技术，成本低、工作量相对小,ALK IHC,FISH,患者 1: IHC显示ALK表达量高， FISH显示重排,患者2: IHC显示无ALK表达， FISH显示无重排,Mino-Kenudson Clin Cancer Res 2010; 16:1561-1571.,IHC需要标准化,从临床试验过渡到大规模使用IHC 前，还需要对以下方面进行规范： 最好的抗体和检测系统是什么 应采用哪种评分系统 有哪些生物学相关的截止点 采用适当的质量控制,Adapted from Yi et al., J Thorac Oncol 2011; 6:459-465 and Mitsudomi et al., ASCO 2011, Abs #7534,研究中的检测ALK重排的其他检测方法,多重 RT-PCR用于筛查所有ALK 融合变异体1,2,显色原位杂交技术(CISH) 3 使用标准明视野显微镜， 数据可存档 465例样本结果显示与FISH (k=0.92) 和IHC (k=0.82)高度一致,分离型CISH 探针显示ALK 重排,Takeuchi 等报道的新发现的EML4-ALK变异体4的RT-PCR结果,1. Takeuchi et al., Clin Cancer Res 2008; 14:6618-6624 2. Li et al., ASCO 2011; Abs #10520 3. Kim et al., IASLC 2011; Abs #O05.02,RT-PCR检测到的多个EML4-ALK变异体,Danenberg et al., ASCO 2010, Abs #10535,优化ALK 检测的主要因素,。