高效液相色谱法

第12章 高效液相色谱法high performance liquid chromatographyHPLCHPLC与经典LC区别经典液相色谱现代液相色谱 固定相颗粒较大，不均 匀固定相颗粒小，均匀常压下输送流动相高压下输送流动相 柱效低柱效高 分析周期长分析周期短第2节 基本理论-速率理论一、柱内展宽Csm为静态流动相传质阻力系数组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰 展宽影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度1. 涡 流 扩散 项 A减少方法 ：a 降低dp：目前商品柱多采用3-5μm粒径b 降低λ：采用球形、均匀分布固定相B=2γDm Dm ∝T/η 2. 纵 向 扩 散 项 B/u样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起 峰展宽u是最佳流速的3-5倍B/u忽略液相色谱中Dm比GC中小1053.流动的流动相传质阻力项Cmu流动相本身，处于不 同层流的分子具有不 同流速Dm ∝T/η减免方法：1）减少固定相颗粒直径2）减少流动相液体黏度（甲醇）4. 静态流动相传质阻力项Csmu原因：处于固定相颗粒 内部孔洞内静态流动相 引起影响Csmu的因素与Cm相同5. 固定相的传质阻力项Csu影响因素：固定相内部阻力影响 减免方法：减少固定相液膜厚度——化学键合相 6、HPLC法中分离条件的选择H = A + （Cm+Csm）u1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装 柱2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 1ml/min 3. 柱温的选择：选室温25-300C左右。

太低，流动相黏度增加 ，太高容易产生气泡二、柱 外 展 宽减免方法：应尽可能减少柱外死体积从进样器到检测器之间的体积称柱外死 体积，均可导致色谱展宽，柱效下降第3节 各类高效液相色谱法吸附色谱法化学键合相离子对色谱法一、吸 附 色 谱 法1．分离原理2．固定相：极性和非极性固定相3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 二、 化学键合相色谱法（bonded phase chromatography, BPC）化学键合相：采用化学反应的方法 将固 定液的官能团键合在载体表面上优点：固定相不易流失适用于各种样品的分离分析正相键合相色谱法：极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物反相键合相色谱法：非极性键合相，如C18柱、C8柱适用：非极性至中等极性化合物分 类1）分离原理 流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键 合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可 逆的k↓，组分tR↓1、反相键合相色谱法（RP-HPLC）2）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱）十八烷基键合相：常用的非极性键合相反相键合相色谱法（RP-HPLC）低碳型： R1、R2都是氯高碳型：R1、R2是两个甲基特点：载样量大，保留能力强键 合 相 分 类中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为氯表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目， 占硅胶表面硅醇基总数的比例。

作用：决定了键合相是分配还是吸附占 主导封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在 键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子 进行钝化处理3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性 > 固定相极性底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃反相键合相色谱法（RP-HPLC）4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6）适用：非极性-中等极性组分反相键合相色谱法（RP-HPLC）用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇-水 （95：5）问：①哪个先出柱②若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例?例：1）分离机制：2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相3）流动相：极性小底剂 + 有机极性调节剂 ü 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2、正相键合相色谱法（NP-HPLC）4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5）出柱顺序：极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱正相键合相色谱法（NP-HPLC）6）适用：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等3．离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸 2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱3．洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5m） 色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。

流动相：(A) 乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱：0-30min：A 28%，B 72%； 30-53min： A 28％升至34％，B 72％降至66％；53-70min： A 34％升至80％，B 66％降至20％流速：1.0 ml·min-1；检测波长：275 nm；进样量：20μl；柱温：30℃；流动相的性质和选择 1、流动相的物理性质 1)流动相要求： ①易得易纯化，无毒不易燃 ②检测器的适应性:如紫外检测器对 溶剂的透明波长要求；示差折光不能 用梯度洗脱 ③对样品有一定溶解度而不反应 ④纯净,低廉,低粘度(5×10-4Pa.S), 低沸点(>柱温(20~50)) 2)流动相的物理性质沸点bp、分子量M、密度、介电常数e 粘度η、折射率RI、紫外吸收截止波长 溶剂强度参数ε(Al2O3)、溶解度参数 δ(色散δd、取向极性δ0、受质子δa 给质子δh)、溶剂极性参数P/ (质子接 受xe、给质子xd、偶极xn)、选择性分 组、表面张力、离子对色谱溶剂强度 (P/+0.25e) 常用于HPLC流动相溶剂的性质溶剂剂P/εXeXdXn选择选择 全氧烃烃<-20.25 正戊烷烷00 正已烷烷0.10.01 正庚烷烷0.20.01 环环已烷烷-0.20.04 四氯氯化碳1.60.18 苯2.70.320.230.320.457 甲苯2.40.290.250.280.477 乙醚醚2.80.380.530.130.341 二氯氯甲烷烷3.10.420.290.180.535 正丙醇4.00.820.540.190.272正丁醇3.90.70.590.190.252 四氢呋氢呋 喃4.00.570.380.200.423 乙酸乙酯酯4.40.580.340.230.436 氯氯仿4.10.400.250.410.337 甲乙酮酮4.70.510.350.220.437 二氧六烷烷4.80.560.360.240.406 吡啶啶5.30.710.410.220.363 硝基乙烷烷5.20.600.280.290.437 丙酮酮5.10.500.350.230.426 乙醇4.30.880.520.190.292 乙酸6.01.00.390.310.304 乙腈腈5.80.650.310.270.426 DMF6.40.390.210.403 二甲亚砜亚砜7.20.750.390.230.393 甲醇5.10.950.480.220.312 硝基甲烷烷6.00.640.280.310.407 乙二醇6.91.110.430.290.284 甲酰酰胺9.60.360.330.304 水10.20.370.370.258①溶剂的强度因素ε,P/ 规定：戊烷在Al2O3的ε=0ε(硅胶)=ε(Al2O3)×0.77 混合溶剂 ?N摩尔分数;nB为吸附剂吸一个B分子所占面积,β吸附剂 活性。

一般0.6≤β≤1.0, nB=4-6随B分子体积而变化 ε0：液-固色谱中溶剂强度参数，反 映溶剂分子对吸附剂亲和力 经验：ε0减小0.05，k值增加1~3倍②溶解度参数δEC是1mol气体变液体释放能量; Vm液体摩尔体积 δ=色散δ+偶极δ+接受质子δ+给出质子δ③极性参数P/ Kg为极性分配系数P’:液-液色谱溶剂极性参数，表示溶 剂洗脱强度和溶剂的选择性经验：P’改变2单位，k值改变10倍极性参数P与溶剂强度参数关系[投影]溶剂剂PXeXdXn溶剂剂PXeXdXn正戊烷烷0乙醇4.30.520.190.29 正已烷烷0.1乙酸 乙酯酯4.40.340.230.43苯2.70.230.320.45丙酮酮5.10.350.230.42 乙醚醚2.80.530.130.34甲醇5.10.480.220.31 二氯氯甲 烷烷3.10.290.180.53乙腈腈5.80.310.270.42正丙醇4.00.540.190.27乙酸6.00.390.310.30 四氢呋氢呋 喃4.00.380.200.42水10.20.370.370.25氯氯仿4.10.250.410.33④粘度参数注意:溶剂常用0.4-0.5mPa.s,太大柱 效下降,大小易成气泡,混合时一般粘 度变化非线性 1 2 3 4水0B1001.正丙醇 2.乙醇 3.甲醇 4.乙腈2、溶剂的选择性与分类(Snyder)K与分子之间作用力？色散力、偶极力、氢键力参考物的选择 (Snyder法) 强偶极作用------硝基甲烷-------Xn 质子给予体------乙醇-------------Xd 质子接受体------二氧六环-------Xe 参考物与被检溶剂间作用力关系表参考物给质给质 子— 乙醇受质质子— 二氧六环环强偶极— 硝基甲烷烷 被检检溶剂剂 作用力接受质质子 作用力Xe给质给质 子作 用力Xd偶极作用 力Xn表2 Snyder的溶剂选择性分组 混合溶剂P/：?注:模糊聚类法 把溶剂对质子给予体、质子接受体、电 子给予体、电子接受体和定向作用力化 合物的选择性五个参数进行分类，选择 21种常用溶剂 表 混合溶剂的溶剂特性举例：在反相色谱中，计算甲醇-水 (60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用 相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃 和水其比例是多少？解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和 水的溶剂强度S分别为2.6,3.2,4.5,0 甲醇-水：S=0.60×2.6+0.40×0=1.56乙腈-水 S=X×3.2+(1-X)×0=1.56 X=0.49 THF-水 S=X×4.5+(1-Y)×0=1.56Y=0.35 2)选择一般原则正相键合相 反相键合相 主体溶剂 正已烷(正庚烷、正戊烷) 水 选择性溶剂 a.质子接受体 乙醚或甲基叔丁基醚 甲醇* b.质子给予体 氯仿 乙腈* c.偶极 二氯甲烷 四氢呋喃*3溶剂优化的步骤 ：1.首选择溶剂 2.多元溶剂系统组成 3.洗脱能力的选择(ε,P/,S)调k 重点组分k=(t-t0)/t0 ≈3 4.改变溶剂系统改变选择性 5.混合溶剂优化 6.PH缓冲剂、胺、配合物、添加剂 离子强度调节剂 7.组分性质差别大可用梯度洗脱如:四面体-三角形法 1选择乙腈-水, 2.比例100%往下调节确定k值而得最 适合的比例.图9-29 3.改变溶剂:甲醇-水;THF-水比例计算 找等洗脱强度三角形图9-30 4.混合溶剂:三元、四元图9-335.七种溶剂流动相色谱分析 图9-344、色谱分离条件的优化指标 1)色谱响应系数其中:P=f/g,n相邻峰对。