实验五实验五 DNA 的限制性内切酶酶切反应的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的一、实验目的通过本实验掌握 DNA 的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程二、实验原理二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP 的存在Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如 Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' Pvu I 的识别序列 5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴ ＣＧ…3'三、实验仪器与设备三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂四、实验材料与试剂pUC18 质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社）Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在 pUC18 质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X 的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为 1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液： （使用时稀释 10 倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的 eppendorf 管(最好 0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入 pUC18 质粒 2μl（1μg） 和相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl,再加入重蒸水 15μl（使总体积为 19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入 1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机 2000rpm 数秒,使溶液集中在管底。
2. 混匀反应体系后,将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温 2--2.5 小时,使酶切反应完全 3.每管加入 2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用可以不加)4.制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果配制 1.0%琼脂糖凝胶，加入适当的 EB 溶液，制胶取 10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀电泳100V20min，60V，40min电泳结束后，紫外灯下观察结果根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，六六、、注注意意事事项项1、DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性大部分 限制性内切酶 不受 RNA 或单链 DNA 的影响酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应 2、当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头3 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度若两者可用同一缓冲液，则可同时水解 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚 /氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙醇，混匀后置 -70℃低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应4. 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约为 0.5-1μg限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为 37℃)对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶,消化 1-2 小时但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加 2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示构建 DNA 限制性内切酶图谱有许多方法通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度5、许多实验制备的 DNA 不易于降解，需适当增加酶的使用量反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
6、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下，否则酶活性将受影响 图例如下：课后记：本次实验除第一批结果不好外，课后记：本次实验除第一批结果不好外，2,32,3 批都非常理想，分析原因可能是批都非常理想，分析原因可能是酶切时间不够以后需注意：酶切时间不够以后需注意：1、酶切时间一定要足够（>2 小时），否则会切割不好；2、电泳时需要增加一个未酶切质粒点样；便于比较观察；3、制备凝胶是 EB 的浓度适当大些（40-50ul/100ml 胶），使结果更为清晰，便于观察4、加样最好统一进行，先配成量大的混合组分，再分成各管，最后分别加酶3000rpm 离心数秒 2012.12.08 记pUC18/ pUC19 简介简介pUC18、pUC19 的区别： pUC18 质粒载体与 pUC19 质粒载体除了多克隆位点 （Multiple Clone Site）部分反向互补外，其它部分完全一样 pUC19 质粒载体图谱p pU UC C1 18 8 质质粒粒载载体体图图谱谱 特特征征：： Vector size (bp) 2686Multiple cloning site 399-455LacZ α-peptide 146-469 Ampicillin resistance gene 1626~2486 pUC origin黄色区域为多克隆位点 下划线部分为 lac 启动子 蓝色字体删除线 M13 引物 红色字体 α 链 蓝色字体 amp 抗性基因 蓝色背景为蓝色背景为 PVU I 酶切位点酶切位点TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGG TCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAG CGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC TGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACC GCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGC GGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAA GTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCC AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA CAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTA ACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGC CAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGG TATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAG GAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCG TTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCT CAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGC CTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTT CGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGA CCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT GCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTT GGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGAT CCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTAC GCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGC TCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGAT CTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATAT GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA TCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATA CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCA CCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGT。