大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一 可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS 或 50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法 2.1 反复冻融 2.1.1 收集菌液 500ml，等分 10 份，4000 r/min 4℃离心 15min，弃上清 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的 50mM PBS 或 50mM Tris-HCl（选择使 蛋白稳定的缓冲液和 pH）重悬洗涤一次 2.1.3 然后按原菌液体积的 1/4 加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂 PMSF 和 EDTA(带 His 标签不加)，PMSF 终浓度为 100μg/ml, EDTA 的终浓度 为 取 20μl 重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性 表达还是包涵体表达） 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80 度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融 三次） ，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构 破碎 2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入 1mg/ml 溶菌酶，缓冲液 pH＞8.0，加 入后需静置 20min） ，进行超声破碎，超声条件：400W，工作 5 秒，间隔 5 秒， 重复一定次数， （根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件） 。
直至菌体溶液 变清澈为止，大约花费时间 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm 离心 10 分钟，分别对上清和沉淀 进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的 含量注意事项： （1） 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间， 降低蛋白被降解的可能 （2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在 4 度左右， 超声时保持冰浴 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用 Bradford 法或者紫外吸收法 （4）可通过 SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量二 包涵体蛋白的纯化 1 菌体的破碎 （加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶 菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1 仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS 或 20mM Tris-HCl pH 7.5；裂 解液 buffer A；溶菌酶 10mg/ml；50ml ，15ml 离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液 500ml，等分 10 份，4000 r/min 4℃离心 15min，弃上清。
2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的 20mM PBS 或 20mM Tris-HCl（选择使 蛋白稳定的缓冲液和 pH，一般为 7.5-8.0） ，重悬洗涤 2-3 次，弃掉上清 （3）然后沉淀按原菌液体积每 500ml 以 15ml 预冷的裂解液 bufferA 重悬有 的文献为每克湿菌加 4ml -10ml 裂解液) （4）每毫升悬液中加入 100ul 10mg/ml 溶菌酶（即溶菌酶终浓度 1mg/ml） 在 冰上孵育 15min （5）对 15ml 悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作 5 秒，间隔 5 秒，重 复一定次数超声破碎时保持冰浴具体条件可根据实验情况而定 （6） 4℃，4000 rpm/min 离心 20 分钟所得沉淀即为包涵体 注意事项：融合蛋白的分子量如果大于 150KD 时，用超声波破碎很容易将目标 蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2 包涵体的洗涤 (1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的 Buffer A 中，每克湿重加 4- 6ml 洗涤液 (2) 超声波处理 5 秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃ 涡旋悬液 30min。
或者高速搅拌悬液 10min (3) 4℃，4000 rpm/min 离心 15 分钟 (4) 重复上述操作 2 次至上清液透明无色 (5) 将包涵体沉淀重悬于 Buffer A，4℃，4000 rpm/min 离心 15 分钟，弃掉上清注意事项： (1) 包涵体洗涤时增加 NaCl 浓度到 0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解 (2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原 SDS-PAGE 电泳结合光密度扫描可知 包涵体中目标蛋白的含量 (3) 包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得 到不同的纯度 50mM Tris-HCl pH 8, 0.2mM EDTA, 100mM NaCl, 1% Triton x- 100 （或 2% 脱氧胆酸钠） 1mM DTT 1mM PMSF 10mg/ml 大肠杆菌表达重组 蛋白的超声破碎及纯化 (4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初 纯包涵体，步骤如下： (1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含 6mol/L 盐酸胍的 Buffer A 中，4℃涡旋 悬液 30min ，4000r/min 离心 20min，上清进行分级沉淀。
(2) 取一小部分上清用 Buffer A 稀释到盐酸胍浓度为 4 M，然后 4℃涡旋悬液 15min，静置 30min，4000r/min 离心 20min，上清继续稀释到 3M，重复上面操 作一直到 2M，把每次沉淀和上清跑 SDS-PAGE 电泳分析，看目标蛋白在哪个 盐酸胍浓度下纯度最高 (3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用 Buffer A 稀释到所需的盐酸胍浓度， 然后 4℃涡旋悬液 15min，静置 30min，4000r/min 离心 20min，沉淀既为分级沉 淀后的包涵体 超声破碎在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪离心 1.0～1.5ml 诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入 300～500μl 的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各 个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书常规操作步骤如下（以 100ml 培 养液为例）： （1）100 ml 诱导后的菌液（OD600=1.2 左右） ，12000 rpm，4℃离心 2min， 收集菌体 （2）加入预冷的缓冲液 50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000 rpm，4℃离心 2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为 PBS 或者 Tris-NaCl，针对 不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。
对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白， 可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂 （3）向沉淀中加入 15ml 的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍） ，充分悬浮，将 菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中 （4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部， 每处理 30sec 间隔 1min 使菌液冷却，输出强度为 5～6，频率为 60～70％ （5）分离上清和沉淀：12000 rpm，4℃离心 20min，分离上清和沉淀 （6）SDS-PAGE 分析蛋白表达情况 （7）准备纯化蛋白超声破碎注意事项与一些小的改进：（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈 （2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强 （3）超声时间太长、功率 太高对蛋白活性肯定有影响 （4）尽量防止泡沫的产生 （5）大量破碎时将菌 液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的 破坏作用 （6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁 （10min，30℃） ，增加细胞的通透性。