生物化学实验一、蛋白质等电点的测定、蛋白质沉淀、变性及呈色反应实验一、蛋白质等电点的测定、蛋白质沉淀、变性及呈色反应一、蛋白质等电点的测定一、蛋白质等电点的测定【实验目的】 掌握蛋白质的两性解离性质；初步学会测定蛋白质等电点的一种方法；掌握蛋白质变 性与沉淀的关系 【实验原理】 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基酸的氨基 与羧基成肽键结合，但总有 一定自由氨基与羧基以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱集团，因此蛋白质和氨基酸一 样是两性电解质调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷 和负电荷相等，以两性离子状态存在，在电场内该蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移 动，这时溶液的 pH 值，称为该蛋白质的等电点当溶液的 pH 低于蛋白质等电点时，蛋白 质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的 pH 高于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷成为 阴离子 由于在等电点时，蛋白质分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在 溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚 而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
等电点时的许多 物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤在等电点外的所 有其他 pH 值，依据蛋白质所带净电荷采用电泳和离子交换层析来分离和分离纯化该蛋白 质 蛋白质等电点多接近 pH 7.0，略偏酸性的等电点也很多，如白明胶的等电点为 pH 4.7；也有偏碱性的，如精蛋白的 pH 10.5-12.0.在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀 析出 【实验材料】 酪蛋白、醋酸钠、醋酸【实验器材】 水浴锅，研钵，250ml 容量瓶 4 个，试管 8 支，刻度吸管 1 或 2ml 3 支，5ml 吸管 2 支，小滴管一支【试剂配制】 1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白 1.0g ，加少量蒸馏水在研钵中仔细研磨， 将所得蛋白溶液移入 200 锥形瓶中，并用少量 40℃-50℃的温蒸馏水洗涤研钵，将洗液也 移入锥形瓶中，加入 25ml 1mol/L 醋酸钠溶液(20.5g 醋酸钠溶于 250ml 容量瓶中)把锥 形瓶放入 50℃水浴中，小心的摇动锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止将锥形瓶中的溶液 全部移至 250ml 容量瓶中加蒸馏水至刻度线，混匀 2、1mol/L 醋酸溶液（配置：若 36%醋酸，取 167ml 加蒸馏水至 1L 即可；若是冰乙酸， 则直接取 60g,或取 57.14ml 加蒸馏水至 1L）。
3、0.1mol/L 醋酸溶液 4、0.01mol/L 醋酸溶液方法与步骤】1.取同样规格的 4 支试管，按下表顺序分别加入各试剂，然后混匀试管号蒸馏水 (ml)0.01mol/L 醋酸 （ml）0.1mol/L 醋 酸（ml）1mol/L 醋 酸（ml）最终 pH13.40.6------------5.921.5------2.5------5.333.0------1.0------4.742.4------------1.63.52.向以上试管中加入含有酪蛋白的醋酸钠溶液 1ml，加入试管后立即摇匀，并观察其浑 浊度，1，2，3，4 管的 pH 值依次为 5.9、5.3、4.7、3.5静置 10 分钟后，再观察其浑浊 度并判断其等电点 【实验结果】 注意各个试管的变化，分别用—，+，++，+++，++++表示各管沉淀量的多少，根据 观察的结果，指出哪一个 pH 是酪蛋白的等电点 【思考题】1、什么是蛋白质的等电点？在等电点时，蛋白质溶液的物理性质会发生什么变化？2、利用蛋白质等电点时物理性质的变化，可以有什么实际的应用？二、蛋白质的沉淀及变性及呈色反应二、蛋白质的沉淀及变性及呈色反应【实验目的】 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；掌握沉淀蛋白质的几种方法及实用意义；熟 悉蛋白质变性与沉淀的关系。
【实验原理】（一）蛋白质的沉淀反应在水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层而形成亲水性的胶体颗粒，在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒的稳定因素被破坏或与某些试剂结合形成不溶解的盐后产生沉淀蛋白质的沉淀反应可分为两类：1．可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后沉淀的蛋白质溶解于原来溶剂中，并保持天然性质引起可逆沉淀的因素主要有：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，此过程也称为盐析）、低温下与乙醇或丙酮短时间作用等除去这些因素后，蛋白质又能溶解分离提纯蛋白质时，常利用此类反应2.不可逆沉淀反应：在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下，蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质因变性而沉淀，除去引起的沉淀因素后，蛋白质不再溶于原来的溶剂中变性与沉淀的区别：变性强调构象破坏，活性丧失，但不一定沉淀；沉淀强调胶体溶液稳定因素被破坏，构象不一定改变，活性也不一定丧失，所以不一定变性二）蛋白质的主要特征性颜色反应1．双缩脲反应双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)是两个分子脲(即尿素)经 180℃左右加热，放出一个分子氨(NH3)后得到的产物具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂（碱性的Cu2+的溶液）产生紫色反应。
蛋白质的肽键在碱性溶液中能与 Cu2+络合成紫红色的络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比2.茚三酮反应除脯氨酸、羟脯胺酸能与茚三酮反应生成黄色物质外，所有的 α-氨基酸及蛋白质与茚三酮共热，则产生紫色的还原型茚三酮、茚三酮与氨的缩合物此反应适宜的 pH 为 5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的 pH 条件下的颜色反应深浅不同，酸度过大时甚至不显色该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法实验药品】 蛋白溶液：10%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）；3%硝酸 银溶液；1％硫酸铜；10％Na0H；0.1％茚三酮乙醇液(0.5g 茚三酮溶入 500ml 乙醇中) 【实验器材】 试管、移液管，胶头滴管，烧杯，玻璃棒，电炉，试管架、试管夹、试管刷等 【方法与步骤】 1.蛋白质的盐析 试管中加入少量 10%卵清蛋白溶液，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分 钟则析出球蛋白的沉淀，加入水，观察沉淀是否溶解；2.重金属离子沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液 2ml，加入硝酸银溶液 1-2 滴，震荡试管，立即产生沉 淀，放置片刻后倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，观察沉淀是否溶解； 3.双缩脲反应取小试管一支，加 1：10 鸡蛋白液 2 滴、10％Na0H 溶液 5 滴及 1％硫酸铜溶液 1 滴， 混匀后，呈紫红色的双缩脲反应。
4.茚三酮反应取小试管 1 支，加 1：10 鸡蛋白溶液 4 滴，蒸馏水 5 滴和 0.1％茚三酮乙醇液 6 滴， 混匀，于沸水浴中加热约 1 分钟，待冷却后溶液即呈粉红色，以后慢慢变成紫色或蓝色 【实验结果】 注意观察各个试管内的变化，主要包括是否变浑浊或者是沉淀，变浑浊或者沉淀后加 入水或者试剂是否会溶解；试管内颜色是否变化，是什么颜色出现，颜色变化出现后是否 稳定 【注意事项】 1.注意实验的安全性，本实验需要沸水加热 【思考题】 1.蛋白质沉淀和哪些因素有关，与蛋白质等电点有何关系？ 2.蛋白质沉淀、变性、凝固三者之间的关系如何？实验二、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验二、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量【实验目的】 掌握蛋白质含量测定的原理和方法；掌握分光光度法的原理及 722 型分光光度计的使 用方法；标准曲线法准确测定未知样品中蛋白质的含量 【实验原理】 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白 浓度的快速、灵敏的方法 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色考马斯亮蓝 G-250 在酸 性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在 465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸 收在 595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为 595nm 处的光吸 收与蛋白质含量成正比，通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和考马斯亮蓝 G-250 结合，在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅 速，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得 在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量 【实验药品】 绿豆芽、考马斯亮蓝 G―250、结晶牛血清蛋白、NaCl、擦镜纸【实验器材】 电子天平；分光光度计；试管架；试管 6 支；刻度吸管 1ml 或 2ml 2 支，比色皿；离 心机、离心管、研钵；50mL 容量瓶；50mL 小烧杯 【试剂配制】 考马斯亮蓝 G―250： 100mg 溶于 50ml95%乙醇中，加入 100ml 85%（W/V）磷酸， 用蒸馏水稀释至 1000ml，滤纸过滤最终试剂中含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇标准蛋白质溶液：准确称取 10mg 牛血清蛋白，用 0.9%的 NaCl 稀释至 100ml，即为 0.1mg/ml 的原液【方法与步骤】 1.牛血清蛋白标准曲线的制作试管号123456标准蛋白液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白浓度(μg/ml)020406080100G-250 （ml）555555各管混匀后 2 分钟，以 1 号管作空白对照，测定各管 595nm 下的吸光值，以吸光值为纵坐 标，蛋白质溶液的浓度为横坐标作图，得标准曲线。
2.未知样品中蛋白质溶液的测定 准确称取玉米下胚轴 2g，加入 2ml 蒸馏水研成匀浆，转移至 100ml 容量瓶，再用蒸馏 水分次充分洗涤研钵，洗涤液收集一并合如容量瓶，定容为 100ml，放置 10 分钟以充分提 取蛋白质；用离心机 3000 转/分钟离心 10 分钟，上清液置入小烧杯即为未知待测液 取未知浓度的蛋白液 1ml 加入试管，再加入考马斯亮蓝 G-250 染色液 5ml 混匀，测定 595nm 下的吸光值，对照标准曲线求出未知蛋白液的浓度 【实验结果】 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋自质含 (ug) ，计算每克 鲜重蛋白质的含量：豆芽中的蛋白质含量（%）=100106 WNVCC：标准曲线查得的蛋白质浓度（μg/ml） V:：稀释体积（ml） N：稀释倍数(10) W：样品质量（g） 【注意事项】 1.玻璃仪器要洗涤干净； 2.取量要准确 3.在试剂加入后的 5-40 分钟内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的 4.测定中，蛋白-染料复合物有少部分吸附于比色杯壁上，测定完成后可用乙醇将蓝色 的比色杯洗干净 【思考题】1.考马斯亮蓝 G - 250 法测定蛋自质含量的原理是什么？还有哪些蛋自质定量法？ 2.如何正确使用分光光度计？实验三实验三 影响酶活性的因素影响酶活性的因素【实验目的】掌握影响酶活性因素的实验；熟悉影响唾液淀粉酶活性因素的实验方法；掌握温度、 抑制剂、pH 对酶活性影响的机制。
【实验原理】 酶是生物体中具有催化功能的一类蛋白质，因此它的催化作用受温度的影响很大当反 应速度最快时的温度称为此酶作用的最适温度大多数动物酶的最适温度为 37～40℃ 酶的活性受环境 pH 值的影响极为显著酶表现其活性最高时的 pH 值称为最适 pH 低于或高于最适 pH 时，酶的活性逐渐降低，不同酶的最适 pH 值不同，例如胃蛋白酶的最 适 pH 为 1.5～2.5，胰蛋白酶的最适 pH 为 8.0 能使酶的活性增加的物质称为激动剂，氯离子对唾液淀粉酶有激活作用使酶的活性 降低的物质，称为抑制剂，铜离子则对唾液淀粉酶有抑制作用 本实验以唾液淀粉酶为例，此酶只能催化淀粉的水解，最终产物为麦芽糖；而不能催 化其它糖的水解反应，如纤维素、蔗糖等 淀粉水解程度不同，遇。