试验分以下几步进行：,(1)饲喂14CO2与定时取样 向正在进行光合作用的藻液中注入14CO2使藻类与14CO2接触，每隔一定时间取样，并立即杀死 H14CO3-+H14CO2+H2O,图 用来研究光合藻类CO2固定仪器的图解,(2)浓缩样品与层析 用甲醇将标记化合物提取出来，将样品浓缩后点样于层析纸上，进行双向纸层析，使光合产物分开 (3)鉴定分离物 采用放射自显影技术，鉴定被14CO2标记的产物并测定其相对数量 (4)设计循环图 根据被14C标记的化合物出现时间的先后，推测生化过程根据图D所显示的结果，即短时间内(5秒，最终到0.5秒钟)14C标记物首先出现在3-磷酸甘油酸(PGA)上，说明PGA是光合作用的最初产物用纸层析和放射自显影技术追踪被14CO2标记的产物,起先猜测CO2是与某一个2碳的片断结合生成3碳的PGA，然而情况并非如此 当光下把CO2浓度突然降低，作为CO2受体的化合物会积累起来这一化合物被发现是含有5个C的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)，当它接受CO2后，分解为2个PGA分子光合试验中RuBP与PGA相互转化,此项研究的主持人卡尔文获得了1961年诺贝尔化学奖。
1.固定（RuBP的羧化） CO2与RuBP结合经水解生成3-磷酸甘油酸(3-PGA) 催化羧化反应的酶是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/ 加氧酶(Rubisco) 2、C3产物的还原 利用光反应生成的ATP和NADPH 将3-PGA进一步还原为磷酸丙糖(甘油醛-3-磷酸，GAP) 3、RuBP的再生 GAP经过3C、4C、5C、6C、7C糖的转化，形成核酮糖-5-磷酸(Ru5P),最后形成RuBP三个阶段：,GAP的走向： （1）叶绿体内合成淀粉 （2）细胞质内合成蔗糖 （3）叶绿体内变为RuBP,,,卡尔文循环的总反应式：,3CO2 + 5H2O + 9ATP + 6NADPH GAP + 9ADP +8Pi + 6NADP+ + 3H+,在此循环中，将光反应中转化的活跃化学能转换为稳定的化学能（能量转化效率达80以上），贮存在磷酸丙糖中二）C4途径,Hatch和Slack研究发现，甘蔗和玉米等植物在光合作用碳代谢过程中，固定CO2的最初产物是苹果酸或天冬氨酸等四碳二羧酸，催化羧化反应的酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC), 这就是CO2同化的C4途径，又称Hatch-Slack途径。
C4植物,高梁,甘蔗田,粟(millet)的穗形, “谷子”，去皮后称“小米”,苋菜,玉米,C4植物叶片结构特点,栅栏组织与海绵组织分化不明显，叶片两侧颜色差异小 C4植物维管束分布密集，间距小，每条维管束都被发育良好的大型维管束鞘细胞（BSC）包围，外面又密接1-2层叶肉细胞，这种呈同心圆排列的BSC与周围的叶肉细胞层被称为“花环”(Kranz,德语)结构，C4植物的BSC中含有大而多的叶绿体，线粒体和其它细胞器也较丰富 BSC与相邻叶肉细胞间的壁较厚，壁中纹孔多，胞间连丝丰富这些结构特点有利于MC与BSC间的物质交换，以及光合产物向维管束的就近转运 两类光合细胞中含有不同的酶类，叶肉细胞中含有PEPC以及与C4二羧酸生成有关的酶；而BSC中含有Rubisco等参与C3途径的酶、乙醇酸氧化酶以及脱羧酶在这两类细胞中进行不同的生化反应C4途径的反应过程,羧化反应 进入叶肉细胞的CO2先形成HCO3-, 再在PEPC催化下，被磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)接受而羧化，形成草酰乙酸(OAA)； 还原或转氨作用 OAA在叶肉细胞的叶绿体中被还原为苹果酸(Mal) ；或在细胞质中经转氨基作用形成天冬氨酸(Asp) ； 脱羧反应 C4酸通过胞间连丝移动到BSC，发生脱羧反应，释放CO2，CO2叶绿体中进入C3 途径，经再次固定、还原而形成磷酸丙糖； 底物再生 C4酸脱羧形成的C3酸从BSC运回叶肉细胞并再生出CO2受体PEP。
图 C4植物叶的结构以及 C4 植物光合碳代谢的基本反应 ( )内为酶名； PEPC.PEP羧化酶; PPDK.丙酮酸磷酸二激酶,C4途径的类型,类 型 转移到维管束 脱 羧 酶 返回叶肉 代 表 植 物 鞘细胞的C4酸 细胞的C3酸 NADP-ME 苹果酸 NADP苹果酸酶 丙酮酸 玉米、甘蔗、高粱 （位于叶绿体） NAD-ME 天冬氨酸NAD苹果酸酶 丙氨酸 马齿苋、狗尾草 (位于线粒体） PEP-CK 天冬氨酸 PEP羧激酶 丙氨酸 羊草、非洲鼠尾粟 (位于细胞质) PEP,根据不同植物形成四碳酸的种类、催化脱羧反应的酶及脱羧反应部位，可将C4途径分为三种类型： （1）NADP苹果酸酶(NADP-ME)型; （2）NAD苹果酸酶 (NAD-ME)型; （3）PEP羧激酶(PEP-CK)型PCK型（ PEP羧激酶型）： PEP carboxy-kinase C4 photosynthesis,NAD+苹果酸酶型: NAD+-malic enzyme C4 photosynthesis., NADP苹果酸酶型： NADP+-malic enzyme C4 phtosynthesis.,C4途径的生理生态意义,在高温、强光、干旱和低CO2条件下， C4植物与C3植物比较，其光合速率高，光呼吸低，减少水分丧失，适应性更强。
原因如下： 1、C4途径中，PEPC与CO2的亲和力极强，能催化固定较低浓度的CO2，且没有与O2的竞争反应，因此固定CO2的效率高 2、由于苹果酸的脱羧反应是一种浓缩CO2的机制，使维管束鞘细胞有较高的CO2浓度，促进了Rubisco 催化的羧化反应,而抑制了加氧反应，降低了光呼吸 3、在维管束鞘细胞中形成的光合产物，可及时运往维管束，避免产生反馈抑制作用但是C4植物同化CO2消耗的能量比C植物多，在光强及温度较低的情况下，其光合效率还低于C植物可见C4途径是植物光合碳同化对热带环境的一种适应方式三）CAM途径,一些热带植物，如景天、仙人掌、菠萝、兰花等，具有特殊的碳固定代谢途径景天科酸代谢途径(CAM途径)剑麻,芦荟,落地生根,龙舌兰,绯牡丹,昙花,CAM植物-瓦松属,瓦松属1,多肉质植物,鸡冠掌,红司,锦晃星,静夜,CO固定昼夜可变化分为4个阶段：,1.阶段 PEPC的羧化阶段夜间气孔开启，CO2被PEPC固定生成草酰乙酸，后者还原成苹果酸贮存于液泡此间CO2固定约占全天固定CO2的3/4左右，而白天贮存的葡聚糖在此期间用于形成PEP 2.阶段 由PEPC羧化转向Rubisco羧化的阶段。
白昼开始时气孔导度与CO2吸收出现一个高峰，此期间C途径与C途径同时进行，苹果酸积累中止 3.阶段 Rubisco同化CO2阶段日间气孔关闭，停止从外界吸收CO2，苹果酸从液泡转移至细胞质，氧化脱羧脱羧释放的CO2进入叶绿体被 C途径同化 4.阶段 由Rubisco羧化转向由PEPC羧化的阶段苹果酸脱羧降至最低点，气孔开始张开，CO2吸收增加，且由C3途径过渡至C4途径，从而又重复下一个昼夜变化周期C3、C4、CAM植物特性比较,特 性 C3植物 C4植物 CAM植物 叶片解剖结构 维管束鞘细胞不发 维管束鞘细胞发达， 维管束鞘细胞 达，内无叶绿体 内有叶绿体 不发达 碳同化途径 C3途径 在不同细胞中存在 在不同时间的 C3和C4途径 两条途径 最初CO2受体 RuBP 细胞质中PEP; 暗中PEP； 维管束鞘细胞 光下RuBP 中RuBP 光合初产物 PGA OAAMal 暗Mal; 光PGA 催化CO2羧化 高Rubisco酶活性 叶肉细胞有高 暗中高PEPC 反应的酶活性 PEPC酶活性；维 酶活性；光 管束鞘细胞中有 下高Rubisco 高Rubisco酶活性 酶活性 光呼吸 高光呼吸 低光呼吸 低光呼吸,C、C、CAM植物的相互关系,从生物进化的观点看，C植物和CAM植物是从C植物进化而来的。
在陆生植物出现的初期，大气中CO2浓度较高，O2较少，光呼吸受到抑制，故C途径能有效地发挥作用 随着植物群体的增加，O2浓度逐渐增高，CO2浓度逐渐降低，一些长期生长在高温、干燥气候下的植物受生态环境的影响，也逐渐发生了相应的变化如出现了花环结构，叶肉细胞中的PEPC和磷酸丙酮酸二激酶含量逐步增多，形成了有浓缩CO2机制的C-二羧酸循环，形成了C-C中间型植物乃至C植物，或者形成了白天气孔关闭，抑制蒸腾作用，晚上气孔开启，吸收CO2的CAM植物 不过，不论是哪一种光合碳同化类型的植物，都具有C途径，这是光合碳代谢的基本途径C途径、CAM途径以及光呼吸途径只是对C途径的补充 由于长期受环境的影响，使得在同一科属内甚至在同一植物中可以具有不同的光合碳同化途径四、光合作用的产物,直接产物：糖类、蛋白质、脂类和有机酸,大多数高等植物的光合产物是淀粉，如：棉花、烟草、大豆等；而洋葱、大蒜等植物的光合产物是葡萄糖和果糖，不形成淀粉一）淀粉与蔗糖的合成,（二）淀粉和蔗糖合成的调节,四、光呼吸（photorespiration）,植物的绿色细胞在光照下不仅进行CO2的同化, 而且存在依赖光的吸收O2和放出CO2的反应。
这一植物绿色细胞在光下才能进行并与光合作用密切关联的特殊呼吸过程称为光呼吸这一过程由叶绿体、过氧化体和线粒体协同完成它以 化合物乙醇酸为底物，故又称为乙醇酸代谢途径或 循环一）光呼吸的生化历程,1、在叶绿体基质中RuBP被氧化成磷酸乙醇酸，催化酶是Rubisco磷酸乙醇酸转化为乙醇酸 2、乙醇酸转移到过氧化物体中，氧化为乙醛酸，经转氨基作用形成甘氨酸 3、甘氨酸进入线粒体，形成丝氨酸丝氨酸返回过氧化物体，转化成甘油酸，再返回叶绿体，转化为3-磷酸甘油酸Rubisco是一种兼性酶，具有催化羧化反应和加氧反应两种功能其催化方向取决于CO2和O2的分压当CO2分压高而O2分压低时,RuBP与CO2经此酶催化生成2分子的PGA，进行光合作用;反之,则RuBP与O2在此酶催化下生成1分子PGA和1分子磷酸乙醇酸(C2化合物),后者在磷酸乙醇酸酯酶的作用下变成乙醇酸，是光呼吸的底物，进入C2途径 光呼吸与光合作用是密切联系的二）C2-cycle与C3-cycle之间的关系,光呼吸产生的原因,Rubisco催化特性,C2-cycle与C3-cycle之间的关系,1.光呼吸与光合作用伴随发生，密切联系，光呼吸是不可避免。
2.光呼吸与光合作用共同竞争底物RuBP和Rubisco，CO2是RuBPoase的竞争性抑制剂，O2是RuBPcase的竞争性抑制剂 3.通过改变CO2或O2的浓度，可以调节光呼吸与光合作用的相对比例 4.从碳素同化的角度看,光呼吸往往将光合作用固定的20-40%的碳素变为CO2放出; 从能量的角度看,每释放1分子CO2需要消耗6.8个 ATP, 3个 NADPH显然,光呼吸是一种浪费在长期的进化历程中光呼吸为什么未被消除掉?,（三）光呼吸生理意义,1.回收碳素，维持C3光合碳还原循环的运转 在叶片气孔关闭或外界CO2浓度低时，光呼吸释放的CO2能被C3途径再利用，以维持光合碳还原循环的运转通过C2碳氧化环可回收乙醇酸中3/4的碳(2个乙醇酸转化1个PGA，释放1个CO2) 2.防止O2对碳同化的抑制，减轻War。