羊胎盘粉枸杞子复合物安全性及对小鼠免疫影响的研究 221000摘要：目的 观察羊胎盘粉枸杞子复合物安全性及对小鼠免疫的影响进行了小鼠急性毒性试验和大鼠30d喂养试验及小鼠免疫力试验分别以羊胎盘粉枸杞子复合物对雌雄小鼠进行经口急性毒性试验；分别以羊胎盘粉枸杞子复合物0.58g/kg·kw、1.17g/kg·kw、2.33g/kg·kw和0g/kg·kw进行30d喂养试验；分别以羊胎盘粉枸杞子复合物0.12g/kg·kw、0.23g/kg·kw、0.70g/kg·kw和0g/kg·kw进行小鼠免疫力试验结果 羊胎盘粉枸杞子复合物对雌、雄小鼠急性经口的最大耐受剂量(MTD) 均大于10.0g/kg·bw，属实际无毒级大鼠30d 喂养试验结果，各个剂量组大鼠各项指标与对照组比较均无显著性差异经口给予小鼠不同剂量的羊胎盘粉枸杞子复合物30d, 与空白对照组比较, 各剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞加与不加ConA孔吸光度差值（OD)与空白对照组比较，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）；中、高剂量组小鼠耳壳增重、NK细胞活性较空白对照组均显著增加，差异有显著性（P＜0.05）。
结果显示羊胎盘粉枸杞子复合物属实际无毒级，安全性较高，且具有增强小鼠免疫力的作用关键词：羊胎盘冻干粉；枸杞子提取物；安全；30天试验；免疫、NK细胞胚盘指的是羊膜囊底部外胚层与卵黄囊顶部内胚层紧密相贴的盘形区域,是妊娠期间母体与胎儿进行物质交换的纽带,能分泌出酶类、激素[1]自古人们就认为胎盘具有强壮身体的作用现代近200篇科学文献论证:羊胎盘含有人体内所需的130多种活性物质及营养成份，37种以上的氨基酸和核酸其中包括8种必需氨基酸，以及丰富的维生素和各种酶类： ①含有与机体功能正常 运转有关的活性多肽和保幼因子、丰富的蛋白质、卵磷脂、脑磷脂、褪黑素、脂多糖、SOD以及多种微量元素； ②含有表皮细胞生长因子、体液调节因子、多种维生素和人体多种生物活性酶类物质；③含有与免疫功能密切相关的干扰素和多种活性免疫因子、活性酶、多肽因子以及多种免疫球蛋白、多种抗体；这些成分都是天然的，极易被人体细胞吸收利用[2-9]枸杞（Lycium barbarum），属茄科多年生落叶灌木，枸杞植物（Lycium plant）的果实为枸杞子，是我国一味传统的常用中药枸杞子又名枸蹄子、西枸杞、枸杞红实、甜菜子等。
其始载于《神农本草经》，被列为上品，谓之：“久服坚筋骨，耐寒暑，轻身不老”枸杞子含有丰富的多糖类、黄酮类、氨基酸及挥发油等研究发现,枸杞子可以增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,使吞噬百分率和吞噬指数均增加[5]近年来大量研究发现,枸杞子,可以增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,使吞噬百分率和吞噬指数均增加同时具有对淋巴细胞增殖、IL-2水平的调节作用,促进细胞免疫,体液免疫功能 ,提高NK细胞活性,提高机体免疫力的作用[10-17]1 材料1.1受试物 羊胎盘粉枸杞子复合物由实验室自制羊胎盘粉以羊胎盘经冷藏、制浆、酶解、蛋白质提取、速冻、冷冻干燥、粉碎所制得枸杞子提取物以6倍水煎煮提取2次，每次2.5h、浓缩、喷雾干燥得到干燥的枸杞子提取物6份羊胎盘粉+1份枸杞子提取物混合制得羊胎盘粉枸杞子复合物，用于小鼠、大鼠的灌胃试验1.2试验动物 清洁级昆明种雌性小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g；大鼠40只，雌雄各半，体重70～80g，用于安全性试验；免疫实验用清洁级ICR小鼠SPF级, 160只，体重20±2g试验动物均由浙江省实验动物中心提供1.3试验主要仪器 旋转蒸发仪、动物天平、电子分析天平、光吸收酶标仪、生物显微镜等。
2 方法2.1 安全性试验方法小鼠急性经口毒性试验 动物禁食(不禁水)16h后，体重18～22g的雌、雄小鼠10只采用最大耐受剂量(MTD)法将受试样品羊胎盘粉枸杞子复合物以10.0g/kg BW剂量对实验动物经口灌胃染毒，灌胃容量按每次20mL/100g体重计，在24h内对小鼠灌胃2次，灌胃间隔时间为6h染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等观察实验末再次对动物称重并观察大鼠30d喂养试验 大鼠随机分羊胎盘粉枸杞子复合物低剂量组（0.58g/kg·kw）、中剂量组（1.17g/kg·kw）和高剂量组（2.33g/kg·kw）和空白对照组，每组10只，雌、雄各半，连续喂养30 d每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒症状和死亡情况，实验开始及实验后每周称量1次动物体重，每周2次记录饲料摄入量，计算每周及总的食物利用率实验期末禁食16 h，眼球取血，断头处死，对每只大鼠进行脏器大体观察，取肝、肾、脾、睾丸称重并计算脏体比，同时进行血象、血生化检查，留取肝、肾、脾、胃、肠、睾丸、卵巢进行病理组织学观察2.2增强免疫力试验方法 分别以0.12g/kg·kw 、0.23g/kg·kw、0.70g/kg·kw剂量灌胃小鼠，另设空白对照组以无菌水代替受试物，经口每日1次给予小鼠相应剂量的受试物。
小鼠灌胃量0.1mL/10gbw 三个剂量组和空白对照组连续灌胃30天后，分别进行ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验、小鼠迟发型变态反应(耳肿胀法)、血清溶血素测定、抗体生成细胞检测、小鼠碳廊清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK细胞活性测定2.3数据统计及分析 所有实验数据采用SPSS 16.0软件进行分析3 试验结果3.1安全性试验结果3.1.1 急性毒性试验结果在试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒症状和死亡，到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常雄性小鼠：MTD＞10.0g/kg BW，雌性小鼠：MTD＞10.0g/kg BW表1. 雌雄小鼠急性经口毒性试验结果组别剂量动物（只）死亡数，只死亡率，%MTD（g/kg）雌10.0g/kg1500＞10.0雄10.0g/kg1500＞10.03.1.2 30天喂养试验结果在整个试验期间，动物毛色正常，未见行为异常，无死亡发生羊胎盘粉枸杞子复合物低（0.58g/kg·kw）、中（1.17g/kg·kw）、高（2.33g/kg·kw）各剂量组大鼠的发育状况良好，其体量增重、进食量及食物利用率等与空白对照组相比差别均无统计学意义(P＞0.05)。
羊胎盘粉枸杞子复合物各剂量组的血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类和谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白、白/球比等血液生化指标均在正常范围大鼠脏体比中羊胎盘粉枸杞子复合物各剂量组的肝质量/体质量、脾质量/体质量、肾质量/体质量、睾丸质量/体质量比与空白对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)各组动物大体解剖检查均无异常，肝、肾、脾、性器官等脏器组织学检查结果未发现与实验有关的病变3.2 增强免疫力试验结果3.2.1受试物对小鼠体重的影响 小鼠的初始体重在各实验组与空白对照组之间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)经口给予小鼠不同剂量的羊胎盘粉枸杞子复合物30d后，各剂量组的小鼠中期、末期体重、脏器、脏体比与空白对照组间均数比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明受物对小鼠的体重增长无不良影响3.2.2对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响 经口给予受试物30天后，各剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞加与不加ConA孔吸光度差值（OD)与空白对照组比较，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）；中、高剂量组小鼠耳壳增重较空白对照组显著增加，差异有显著性（P＜0.05）。
高剂量组小鼠血清半数溶血值与空白对照组比较显著增加，差异有显著性（P＜0.05）；各剂量组的抗体生成细胞（溶血空斑数）与空白对照组比较，无明显变化（P＞0.05）表2. 对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响 n=10组别加与不加ConA孔吸光度差值（OD)耳壳增重，mg血清半数溶血值（HC50）溶血空斑数/106脾细胞空白对照组0.006±0.0036.8±3.245±18149±41低剂量0.012±0.007*7.6±1.954±30163±56中剂量0.019±0.018**10.5±3.6*56±27187±64高剂量0.018±0.013**12.2±3.7*78±25*192±75* 与空白对照组P＜0.05，**与空白对照组P＜0.013.2.3对小鼠碳廓清、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响 经口给予受试物30天后，各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数，腹腔-巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数与空白对照组比较无明显影响（P＞0.05)3.2.4对小鼠NK细胞活性的影响 经口给予受试物30天后，中、高剂量组小鼠NK细胞活性显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05)表3. 对小鼠碳廓清、巨噬细胞吞噬鸡红细胞及NK细胞活性的影响 n=10组别碳廓清吞噬指数巨噬细胞吞噬鸡红细胞NK细胞活性吞噬率，%吞噬指数空白对照组5.51±0.9826.0±5.20.33±0.1251.9±17.8低剂量5.58±1.0526.9±4.90.34±0.0762.4±26.1中剂量5.70±1.2027.4±5.50.37±0.0972.3±28.1*高剂量5.81±1.2428.5±6.00.40±0.0872.9±26.3** 与空白对照组P＜0.054讨论急毒试验结果显示，羊胎盘粉枸杞子复合物对雌雄小鼠急性经口的最大耐受剂量(MTD)均大于10.0g/kg·bw，属实际无毒级。
大鼠30d 喂养试验结果，各个剂量组大鼠各项指标与对照组比较均无显著性差异表明羊胎盘粉枸杞子复合物属于实际无毒级，安全性较高增强免疫力试验结果显示，三个剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞加与不加ConA孔吸光度差值（OD)与空白对照组比较，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）；中、高剂量组小鼠耳壳增重、NK细胞活性较空白对照组均显著增加，差异有显著性（P＜0.05）高剂量组小鼠血清半数溶血值与空白对照组比较显著增加，差异有显著性（P＜0.05）表明羊胎盘粉枸杞子复合物具有增强小鼠免疫力的作用引用文献[1] 任兴宏.羊胎盘免疫活性小分子肽的分离纯化[D].西南大学,2010.[2]谷玉,张淑二,章孝荣,等.羊胎盘制剂对小鼠免疫功能的影响.动物医学进展, 2007, 28(7):50-53[3] 谭鹏.浅析羊胎盘保健品的制备工艺及其功效.生物技术世界. 2015年 第6期：233[4]刘士山，张子周，朱和平，等．羊胚胎盘肽功能测试．中国生化药物杂志，2002，23，(5)：236[5]G.Chaouat.Pcental immunoregulatory factors.1987 Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd.Published and printed in Ireland Published and Printed in Ireland：179-188[6] 高利臣，刘宇等．羊胎提取液的实验研究．中国生化药物杂志，2003，24(4)：170．172．[7] 张淑二，张云海，陶勇，等．羊胎盘复方制剂对小白鼠免疫功能和缺氧耐受力的影响．中国生化药物杂志，2008，29(3)：189-191．[8]方。