金黄色葡萄球菌候选特征肽的靶向分析 摘要采用液相色谱串联质谱联用的靶向分析技术，通过检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌水解生成的特征肽，实现食品中致病菌的高效检测针对文献报道的金黄色葡萄球菌的9种候选特征肽，验证了这些特征肽的靶向分析方法，考察和比拟了分析效能结果说明，基于多反响监测模式的靶向分析方法灵敏度高，更适于特征肽的检测;确定了每个特征肽最正确的碎片离子质量，进一步的生物样品分析结果说明，I1〔AYLAVPAAPK〕、I2〔DYNSPTLIGWVK〕、I5〔AGYTVNNTPK〕和I6〔SISSGYTSGR〕更适合作为金黄色葡萄球菌的候选特征肽本研究为大规模验证候选特征肽的鉴定效果奠定了根底，为特征肽检测策略在食源性致病菌检测中的应用提供了参考关键词食源性致病菌;金黄色葡萄球菌;特征肽;液相色谱质谱联用1引言食源性致病菌严重威胁人类健康与公共卫生平安食源性致病菌可以在宿主体内繁殖，并表达毒力因子，进而损伤机体健康尽管公共卫生水平在不断提高，但时至今日食源性致病菌引起的疾病仍频发[1，2]建立准确高效的检验检疫方法，对于食源性致病菌危害的控制、食品平安监管和保障人民身体健康极其重要金黄色葡萄球菌是一种典型的食源性致病菌，常用的检测方法有凝固酶法、酶联免疫法〔ELISA〕、荧光PCR法等。
凝固酶方法基于致病性葡萄球菌产生的凝固酶与纤维蛋白原反响产生的沉淀实现检测【3】，该方法存在灵敏度低、生物危险性大、本钱高、制剂有限等缺点酶联免疫法可以通过金黄色葡萄球菌肠毒素与抗体的相互作用实现快速检测【4】，该方法常由于检测样本中所含无关抗原，造成假阳性结果，并且检测本钱偏高PCR方法[5，6]的特异性好，检测速度快，然而这种基于靶标的方法局限于特定的引物，被检产品中的扩增抑制因子也会干扰检测结果另外，遗传突变等修饰的细菌可能产生假阳性或阴性结果最近，Ward等【7】基于一次性丝网印刷碳电极的电化学阻抗传感器实现了低浓度金黄色葡萄球菌的快速检测，但该方法依赖于特定种属的特征信号因此，开展快速、准确的检测金黄色葡萄球菌的方法具有重要意义随着生物质谱技术的飞速开展，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱〔MALDITOFMS〕已被广泛用于菌种的快速鉴定[8，9]，其在分析速度和易用性方面具有优势，但仍然依赖于菌落的别离和样品纯度高效液相色谱电喷雾三重四极杆质谱〔HPLCESI/QMS〕在多反响检测模式〔MRM〕下，由于对母离子和子离子的靶向选择，可实现极低浓度目标物的超高灵敏检测和定量分析，该技术在食品检疫中常被用于检测农药残留和非法添加等[10，11]。
理论上，采用该技术对致病微生物中的特征多肽序列进行检测[12]，可实现致病微生物的灵敏检测KruhGarcia等[13]采用LCMS/MS对结核病人血清中活性结核菌的Mtb蛋白特征肽进行靶向分析，揭示了可用于诊断结核病的潜在生物标记物Jamnongkan等[14]通过MRM模式比拟胆管癌〔CCA〕患者和正常人的血清的差异肽，发现了4种可用于临床预防及诊断的糖蛋白Rees等[15]利用LCMS/MS的MRM模式检测金黄色葡萄球菌噬菌体K，评价了金黄色葡萄球菌对克林霉素和头孢西丁的抗药性Charretier等[15]采用靶向LCMS/MS检测特征肽的方法，对临床样品中的金黄色葡萄球菌进行菌种鉴定，并对抗生素抗性和毒力进行了评估;通过文献比对和软件预测筛选出候选的特征肽，并对其使用效果进行了考察，证明了通过靶向分析特征肽检测金黄色葡萄球菌的可行性但是，目前尚缺乏对上述策略进行验证和评估的研究报道将该方法和策略拓展到食品中致病微生物的检测具有重要意义建立候选特征肽的靶向分析方法，并考察和比拟多种候选特征肽用于菌株鉴定的分析效能，对于基于特征肽检测食源性致病菌的研究至关重要本研究考察了非靶向分析方法对金黄色葡萄球菌的候选特征肽的检测效果，建立了基于多反响监测〔MRM〕模式的靶向分析方法，比拟和评价了不同候选特征肽的检测效能，为通过特征肽检测食源性致病菌建立方法学根底。
2实验局部UPLCQExactive超高效液相色谱四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱〔美国赛默飞世尔科技公司〕;TripleQuadTM4500UPLCMS/MS液相色谱质谱联用系统〔美国SCIEX公司〕;JY92IIDN超声波细胞粉碎机〔宁波新艺超声设备〕;MilliQAdvantageA10超纯水制备系统〔美国密理博公司〕乙腈〔色谱纯，天津康科德科技公司〕;甲酸〔色谱纯，德国Sigma公司〕;NaCl和NH4HCO3〔分析纯，天津博欧特化工贸易〕;蛋白胨和酵母提取物〔英国Oxoid公司〕金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300和ATCC25923由南京杰肽生物科技合成，详细信息见表1方法2.2.1金黄色葡萄球菌的培养金黄色葡萄球菌ATCC43300和ATCC25923采用营养琼脂培养基〔1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.3%牛肉膏，2%琼脂〕，在37℃培养24h2.2.2样品前处理用接种环刮取培养皿上生长的菌落，悬浮在2mL生理盐水〔0.85%NaCl〕中取1mL，以8000r/min离心15min，沉淀重悬于200μL缓冲液〔50mmol/LNH4HCO3，pH8.0〕中，离心洗涤一次。
将细菌重悬〔100μL50mmol/LNH4HCO3，10mmol/LDTT，pH8.0〕，超声破碎5min8000r/min离心，取上清液，在室温、避光条件下，使用25mmol/L碘乙酰胺进行烷基化按蛋白量与胰蛋白酶质量比25∶1添加胰蛋白酶，在50℃水浴消化15min[16]用0.5μL甲酸酸化樣品终止胰蛋白酶消化消化后的样品直接分析，或在[emailprotected]@20℃下储存，待分析标准菌株ATCC43300和ATCC25923进行非靶向蛋白质组鉴定分析，再通过Mascot软件鉴定蛋白质种类液相色谱条件：VydaxC18色谱柱〔150mm2.1mm，5μm〕;流速0.2mL/min;进样量10μL;流动相A为水，流动相B为乙腈，均含0.1%甲酸洗脱程序：0～5min，5%B;5～30min，5%～40%B;30～40min，95%B质谱条件：加热电喷雾离子源〔HESI〕;正离子模式;采用全扫描模式，粒子范围：m/z300～1500;分辨率70000;Ctrap最大容量〔AGCtarget〕：100000;Ctrap最大注入时间：100ms;鞘气速度：40arb;辅助气流速：3arb;喷雾电压：3.5kV;毛细管温度：300℃。
Mascot软件鉴定蛋白质条件：蛋白质数据库选择SwissProt，蛋白酶种类选择胰蛋白酶，最大漏切位点1个，固定修饰选择Carbamidomethyl〔C〕，可变修饰选择Oxidation〔M〕，分子量误差：1.2Da;电荷类型选择1+，2+，3+2.2.4LCESI/Q的MRM模式靶向分析采用TripleQuadTM4500UPLCMS/MS系统对候选特征肽进行MRM靶向分析色谱条件：VydaxC18色谱柱〔150mm2.1mm，5μm〕;流速0.3mL/min;进样量2μL;流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液洗脱程序为，0～3min，2%B;3～20min，2%～45.5%B质谱条件：采用正离子模式和MRM模式;TurboV离子源雾化温度：550℃;离子喷雾电压：5500V;幕帘气流：172.2kPa;碰撞气流：68.3kPa;GS1〔Ionsourcegas1〕雾化气流：413.7kPa;GS2〔Ionsourcegas2〕辅助气流：379.2kPa;MRM分析方法详见表13结果与讨论理想的致病微生物特征肽，能够严格区分目标微生物菌株与其它种属的微生物菌株。
依靠单一肽很难满足该要求，需要综合使用多个特征肽进行鉴定本研究考察的金黄色葡萄球菌的9种候选特征肽I1～I9〔表1〕，由计算机消化和预测而获得[16]，I1和I2来源于金黄色葡萄球菌双功能自溶素〔Bifunctionalautolysin〕[17]，该蛋白在细胞分裂周期结束时切开连接子细胞的肽聚糖，对菌体增殖有重要意义;I3来源于毒力因子EsxA〔VirulencefactorEsxA〕[18]，I5、I6来源于与毒力相关的葡萄球菌分泌抗原ssaA2〔StaphylococcalsecretoryantigenssaA2〕[18]，其对宿主感染的建立起重要作用;I4来源于核糖体蛋白L20〔50SribosomalproteinL20〕[19]，该蛋白直接与23S核糖体RNA结合，是50S核糖体亚基体外组装的必要条件，参与翻译过程;I7来源于磷酸丙糖异构酶[20]，参与糖异生途径，催化二羟基丙酮磷酸〔DHAP〕转化为d甘油醛3磷酸〔G3P〕;I8来源于ProbabletautomeraseSA1195.1[21];I9来源于UPF0457proteinSA1975.1[21]本研究采用非靶向蛋白质组分析方法检测金黄色葡萄球菌的特征肽。
非靶向蛋白质组分析方法不需要针对特征肽建立和优化特定的方法，易于实施，而且能够获得不限于特征肽的更丰富的多肽和蛋白质种类信息[22，23]在金黄色葡萄球菌两个标准菌株ATCC43300和ATCC25923样品中分别鉴定到5种蛋白质，其中，特征蛋白和特征多肽的鉴定结果如图1所示本研究成功鉴定出7种特征蛋白，但各自鉴定到的肽段种类数量不同〔图1A〕，特征蛋白ATL鉴定到的多肽数量最多，在ATCC25923样品中共鉴定出20种多肽I1～I9中，只有4个特征肽〔I2、I3、I7和I9〕被成功鉴定到〔图1B〕;其它特征肽可能是因为含量较低，所以不能被鉴定到非靶向蛋白质组分析方法虽然获得的信息较多，但是检测灵敏度不高，需要开发靶向分析方法用于特征肽的高灵敏度和全覆盖分析检测方法的考察利用HPLCESI/Q质谱的MRM分析模式，可对特定的母离子子离子对进行选择性检测，进而提高目标物的检测灵敏度Skyline工具可以通过计算机模拟预测碎片离子，Charretier等[15]使用该工具为每个候选特征肽筛选了3个碎片离子，用于MRM模式分析为验证其特征碎片离子的有效性，本研究对特征肽的碎片离子进行了全扫描分析，发现局部特征肽的碎片离子不正确或者不适宜，因此，在此根底上对特征碎片离子进行了调整。
图2展示了特征肽I1调整前后的特征碎片离子由图2A可知，碎片离子m/z766.48和653.39响应较高，而m/z929.5并没有响应，说明该碎片离子不适合图2B为I1碎片离子的全扫描质谱图，在m/z值较大且响应高的3个碎片离子m/z766.48、653.39和58235，选用m/z582.35作为碎片离子更适宜图2C为选择m/z766.48、653.39和582.35作为特征碎片离子进行MRM模式分析的质谱图，3个特征碎片离子都有较高的响应经调整后，最终采用的候选特征肽碎片离子见表1以候选特征肽I1的同位素标记肽为内标，该内标肽IS位于羧基端的赖氨酸〔K〕增加了8Da，所以导致y离子也都增加了8Da，其MRM模式分析方法见表1采用MRM模式靶向分析特征肽等量混合物〔0.1mg/mL〕的色谱如图3所示，可见同一浓度下各个特征肽的响应强度有差异，其中，I4和I1的响应最强，而I8和I9的响应较低特征肽的質谱响应能力越强，在同等浓度下更容易被检出，响应能力很差的肽段不适于作为特征肽由于不同肽在实际样品中的丰度不同，候选肽作为特征肽是否适合，还取决于实际生物样品中的检出效能采用所建立的候选特征肽的MRM靶向分析方法，分析两种金黄色葡萄球菌菌株ATCC43300和ATCC25923胰蛋白酶水解样品中的候选特征肽，结果见图4。
两种菌株水解物中候选特征肽的响应存在差异在菌株ATCC2592。