酶促反应动力学实验报告杨恩原实验目的：1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响在一般情况 下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度［S］的增加而迅速增加，但当底物浓 度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一 个极限值(即最大速度Vmax)底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示 (Michaelis-Menten 方程)即：Ke 十［生］ 、「口 一式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，［S］为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=［S］，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法但 是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax若将米 氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即：丄=矗丄+丄v v^es］ V-以1/V和1/［S］分别为横坐标和纵坐标将各点连线，在横轴截距为T/Km,据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性,再根据1/v和1/［S ］的倒数作图， 计算出其Km值二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂酶的特异性抑制剂大 致上分为可逆性和不可逆性两类可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等竞争 性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响非竞 争性抑制剂的作用特点是不影响［S］与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度 Vmax本实验选取Na HP0作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型2 4实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响试剂(1)(2)⑶⑷(5)⑹(7)⑻(9)0.01 mol/L 基质 液(ml)011111224蒸脩水（ml）4765434201.取试管9支，将L基质液稀释成下列不同浓度:号试剂123456789吸粵上表稀释基质液1ml(1)⑵(3)C4)⑸(6)(7)C8)⑼pH 10碳酸钠缓 冲液(ml〉0.90.90.90.90.90.90.90.90.92.另取9支试管编号，做酶促反应:酶液(ml)0.10.10」0」0」0」0.10」0」pH10碳酸钠缓 冲液(ml)010/16HO/1410/1210/1010/810/610/410/23. 混匀，37 °C水浴保温5分钟左右。
4. 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 C准确保温15分钟5. 保温结束，立即加入LNaOH ml以中止反应各管分别加入% 4-氨基安替比林皿1及％0.5mol/LNaOH(ml)LO1.0LO].()1.0LO1.01.0LO0.3%4-氨基安 替比林(ml)LOLO1.01.01.01.0kO1.0LO0一5%铁筲1化钾(ml)2.02,02.02.02.02.02.02.02.0铁氰化钾ml6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色读取各管吸光度，做记录酶活性计算及Km值计算) 实验计算:1. 在37° C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量(ug).以此计算处各管的酶活性(V)2.以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值A00. 197(J. 2270. 2340. 2900. 3470. 4070. 4710. 631V0& 1139. 72910.02912+ 42914* 87117.44320+ 18627. 0431/v/0. 1180. 1030. 1000, 0800. 0670. 0570, 0500. 0371/S/1.600L 400L 200LOOO0, 8000. 6000. 4000. 200Y=+, Km=实验二:抑制剂对酶促反映的影响^管号 试剂 '、、、⑴(2)(3)(4)(5)(6)⑺(8>(9)0.01 mol/L 基质液(ml)011111224蒸帽水(ml)4765434201.取试管9支，将L基质液稀释成下列不同浓度:^管号试剂123456789吸収上表稀释基质液1ml⑴(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)O.O4m01/L 磷酸 氢二钠(ml)0.10.10.10.10.10.10.10,10.1pHlO碳酸钠缓 冲液(ml)(IX0.S0鸟0.80.80.80.S0.S0.82.另取试管9支，做酶促反应:3.混匀，37 °C水浴保温5分钟左右。
酶液(ml)0.10.10.10.10」0.10.10」111pHlO碳酸钠缓 冲液(ml)010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/24. 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 C准确保温15分钟5. 保温结束，立即加入LNaOH ml以中止反应各管分别加入% 4-氨基安替比林皿1及％铁氰化钾ml0.5mol/LNaOH(ml)KO1,0kOL01+OLOL0E0L003%4-氨基安 替比林(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00,5%铁訊化钾(ml)2.02.02.02.02.02.02.02.02.06.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色读取各管吸光度，并计算各管酶活性实验计算： 以酶活性单位(V)的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度［S］的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描 点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较A00, 1540. 1640, 184V06. 6001. 0297. 8861/v/0. 1520. 1420. 1271/S/1.6001. 4001. 2000,2140,255a 3090. 4240.6029. 17110. 92913+24318. 17125. 8000. 1090.0920. 0760. 0550.0391. 0000.8000. 6000. 4000. 200Y=+, Km=实验分析：通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现,此抑制剂为竞争性抑制剂。
通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/S为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂 后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：Vmax不变，Km变大思考题一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗1.海涅斯-沃尔弗作图法(Hanes-Wolff plo t)双倒数方程式两边同时乘以［S］V V Vmax max2. 伊迪-霍夫斯蒂作图法(Eadie-Hofs tee plo t) 米氏方程式两边均除以［S］二、为什么进行此种酶动力学测定时，所用各底物浓度不是按等差递增在酶浓度和其他反应条件不变的情况下，反应速率V对底物浓度［S］作图呈矩形双曲线当底物浓度较低时，反应速率与底物浓度成正比，反应为一级反应；随着底物浓度的增高，反 应速率不再成正比例加速，反应为混合级反应；当底物浓度高达一定程度，酶被底物所饱和， 反应速率不再增加，达最大速率，反应为零级反应三、酶动力学实验中，哪些因素需严格控制1. 配制的各种试剂及反应液必须混匀2. 加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开始3. 加入酶液后要立即计时，计时要准确4. % 4-氨基安替比林皿1及％铁氰化钾ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时间不可过长。