细胞培育标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培育细胞的正常生长，试验技术人员必需明确并正确执行细胞培育的基本操作步骤，特制订试验室细胞培育操作流程；2．适用范畴：适用于来我院细胞室进行细胞培育工作的人员；3．操作规程：3.1培育液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培育液的配制1、预备用品：培育粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新奇三蒸水（或新奇反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器；紫外线照台30min；2、将培育粉用900ml新奇三蒸水（或新奇反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末；3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌；无需加谷氨酰胺，因该培育基里已含有；4、用1M（1mol/L）HCl调PH至7.0左右（细胞相宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会上升0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）；5、用新奇三蒸水（或新奇反渗水）定容到1000ml；6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水 溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培育液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀；7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培育液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃储存备用；留意：（1）配制培育液及调剂培育液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新奇三蒸水（或新奇反渗水）配制； 一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量；（2）预备的100ml10个玻璃瓶必需事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新奇三蒸水（或新奇反渗 水）的容器均不需高压灭菌，洁净即可；3.1.2PBS（平稳盐溶液）的配制NaCl8gKCl0.2g＋新奇三蒸水（或新奇反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2O1.56gKH2PO40.2g（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃储存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头.）（2）Na2HPO4*H2O1.56g就Na2HPO4*12 H2O需3.4888g（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可3.1.30.25%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉2.5g EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.3g精品. NaCl 8.0g KCl 0.4g ` +新奇三蒸水（或新奇反渗水）至1000MLNaHCO3 0.5g Glucose〔葡萄糖〕1.0g酚红 0.06g（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范畴内，故不需调PH值；（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃储存备用；4℃可连续使用1月左右；（3）用于分装的玻璃瓶必需事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新奇三蒸水（或新奇反渗水）的容器均不需高压灭菌，洁净即可；（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可3.2细胞复苏1、预备：紫外线照台30min，预备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培育基临用前放水浴箱里温育20分钟；在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培育液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸；2、灼烧培育瓶口及瓶盖，用滴管取培育基5ml加入试管中（一滴约为50ul）；3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立刻放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融解；以70%酒精擦拭储存管外部，移入无菌操作台内；（慢冻快融）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培育基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培育基且离心的目的:去除细胞冷冻爱护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀；往试管中加培育基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）；用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培育瓶里成团，影响细胞生长；5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培育瓶中，标记日期、细胞名称，再把培育瓶放入CO2培育箱；（留意：加入到培育瓶后，培育瓶轻轻平放，用手拿培育瓶侧壁，左右上下轻轻摇动几次，使细胞匀称贴壁在培育瓶底；）6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面洁净；留意：（1）入细胞室前观看CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！（2）刚复苏的细胞需要的养分成分更多些，让FBS浓度达到20％；（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，防止对细胞损害较大；（4）滴管使用留意事项： a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管肯定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染；b.培育基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,由于血清对胰酶活性有抑制作用；d．胰酶和PBS（平稳盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开（5）不是全部的细胞复苏后都能活；死亡缘由：冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太猛烈）、细胞传代数太多等；（6）关于PBS（平稳盐溶液）:a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞肯定要插针头；精品. b. PBS和培育基都可以冲洗培育瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质；PBS虽然冲洗杂质成效较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不行常常冲洗细胞；c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的预备，使细胞加入胰酶后易消化；d．消化后临时不养细胞的培育瓶，可以往其中加入2～3ml PBS（防止培育瓶干燥），培育瓶放CO2培育箱里短时间储存；下次用该培育瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培育基冲洗一遍即可再用；（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应准时洗涤冷冻爱护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！3.3细胞换液1、倒置显微镜下观看细胞生长状态：a.移动细胞培育瓶时，观看到呈漂浮状态的细胞为死细胞；b.生长状态良好的细胞：透亮度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞微小结构，细胞处于对数生长期时可以见到许多分裂期细胞；c.生长状态不良的细胞:细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常显现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间间隙加大，细胞变得不规章，失去原有特点；d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和试验；2、紫外线照台30min，预备好吸管、试管饭盒，温育培育基，FBS（胎牛血清）可不温；试验开头时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手；酒精灯点燃放中间；滴管放滴管架上，从左到右次序为：吸细胞液的滴管、吸培育基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管；从水浴箱中取出培育基，擦干水放入操作台的左边；3、从CO2培育箱中取出细胞培育瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（留意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧；细胞培育瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸洁净；留意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培育瓶内，防止产愤怒泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！4、用吸培育基的滴管吸取培育基90滴加入到培育瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培育瓶中；（使FBS浓度为10％）5、旋紧细胞培育瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通；平放回CO2培育箱中；6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面洁净；留意:（1）在打开培育基、FBS（胎牛血清）、培育瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格留意无菌操作；灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开；（2）镊子每次使用前均需灼烧；装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子；（3）滴管在第一次使用前也需灼烧；留意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加；已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！（4）培育瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放；（5）培育液以没过细胞为宜；（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液；不要求每天换液，简单增加污染机会；3.4细胞计数1、原理：（1）运算细胞数目用血球计数盘计数；精品.（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm；当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20.1mm=1.0x10-4ml；使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目；细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4104留意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞运算，如细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液；2、计数方法：〔1〕 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片；〔2〕用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（留意不要溢出，不要有气泡）；〔3〕观看计数：压线的记左不记右，记上不登记；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10）进行计数；细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4104〔4〕计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍；3.5细胞传代1、紫外线照台30min，预备好细胞培育所需物品；2、取灭菌试管1支，配完全培育基（含10%FBS）3ml（培育基:FBS=54滴：6滴）；3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液；4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培育瓶里消化；胰酶铺平培育瓶底为佳；倒置显微镜下观看培育瓶内细胞，一旦发觉大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培育瓶底，马上用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培育瓶放入CO2培育箱让残存的胰酶连续消化，（在37℃胰酶消化成效正确）；5、每1min把培育瓶拿到倒置显微镜下观看，当观看到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培育基3ml加入到培育瓶中终止消化；6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培育瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽视（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处；吹打时尽量防止产愤怒泡，因其对细胞有损害；需轻柔吹打，用。