药学论文-西红花质量评价研究作者：朱友双，牛万刚，姚宝君【摘要】 应用高效液相色谱和 DAD 检测器对上海、浙江、江苏大产地的药材进行了全面质量考察本文可提供清晰的 HPLC 指纹图谱，药材总苷含量在23%～27%之间为优，指纹图谱相似度>0.9西红花总苷的指纹图谱特征性及专属性强，可结合含量测定用于全面控制药材质量，确保每批产品的均一性本文建立了西红花的指纹图谱检测标准，实验方法简便、准确、重复性好 【关键词】 西红花；含量测定；指纹图谱西红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，又名藏红花，被誉为“植物黄金”具有活血化瘀，散郁开结，治忧思郁结，胸膈痞闷，吐血，伤寒发狂，惊怖恍惚，妇女经闭，产后瘀血腹痛［1］本品在历史上依靠进口，见到的样品有外表加油、掺假、含量低现象存在现在我国已引种栽培成功，质量优于进口品，每年并有相当数量的西红花药材出口［2］目前国内已成功开发了西红花总苷片等药物，扩大了内需，因此迫切需要建立一套方便、可行、快速的质量鉴别方法，以便满足工业化生产的需要本实验对我国三大产地西红花药材应用现代色谱法—薄层色谱、高效液相色谱和紫外-可见分光光度法进行方法学研究。
HPLC 指纹图谱首次采用中药质量指纹图谱全谱图相似性计算方法，以指纹图谱和指标成分相结合的方法建立了西红花质量控制标准本文领会了国家药品监督管理局于 2002 年 4 月在上海召开的全国中药注射剂指纹图谱工作会议上的精神通过建立中药材指纹图谱，可以促进同品种中成药各生产企业工艺的统一、规范和优化，稳定产品质量，提高质量标准的可控性，通过现代科学手段让世界了解中药，让中药走向世界1 仪器、试剂与试药1.1 仪器 UV762 双光束紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）LC-10Atvp 岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司） 1.2 试剂 甲醇（色谱纯，杭州汇普化工仪器有限公司）；磷酸二氢铵（分析纯，四川林辰实业集团有限公司）；三蒸水1.3 对照品 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ、西红花苷-Ⅳ1.4 药材来源 见表 1表 1 西红花药材来源1.5 药材重量 见表 2表 2 药材重量2 西红花药材质量分析2.1 紫外-可见分光光度法测定西红花药材总苷含量2.1.1 样品液、标准液及供试液的制备2.1.1.1 样品液 分别称取十个批号的药材一定量研成细粉，取 60mg 精密称定，70℃加甲醇索氏提取至溶液无色，冷却，甲醇定容至 100ml 容量瓶。
2.1.1.2 标准液 取西红花苷-Ⅰ对照品用甲醇制成 0.02mg/ml 标准液2.1.1.3 供试液 分别精密吸取上述样品液各 1ml，甲醇稀释，定容至20ml2.2 测定波长的选择 西红花紫外-可见测吸收曲线，分在λmax（432±2）nm 及（458±2）nm 处有最大吸收2.3 西红花药材总苷含量测定 取十个批号药材供试液以西红花苷-Ⅰ为基准物，433nm 处测定吸收度见表 3表 3 西红花药材总苷含量2.4 HPLC 指纹图谱2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2 250×4.6mm,5μm;流动相：甲醇-水（53：47）；甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（48：52）；流速 1ml/min;柱温 30℃；检测波长 440nm2.4.2 样品液及标准液制备 2.4.2.1 样品液 分别称取十个批号的药材研成细粉，精密称取 60mg，甲醇索氏提取至无色，甲醇定容至 100ml2.4.2.2 标准液 取西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和西红花苷-Ⅲ、西红花苷-Ⅳ混合物对照品用甲醇制成 0.03mg/ml 标准液2.4.3 指纹图谱技术对西红花药材质量评价2.4.3.1 流动相的考察与优化 分别用甲醇-水（50：50）、甲醇-水（53：47）、甲醇-水（55：45）、甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（50：50）、甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（48：52）、甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（45：55）六种体系进行洗脱，结果以甲醇-水（53：47）和甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（48：52）体系得到的色谱峰形较好，尤其以甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（48：52）峰形最好，分离度高，大部分得到基线分离，且较稳定。
2.4.3.2 参照峰的选择 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ为指纹图谱中峰面积积分值较大、出峰时间较早、很稳定的两个峰，而且均可制备纯度>98%的对照品，西红花苷-Ⅲ和西红花苷-Ⅳ为指纹图谱中峰面积积分值较小、出峰时间较晚、两个峰较稳定2.4.3.3 指纹图谱的测定 精密吸取药材提取液 2ml，甲醇定容量至10ml，精密吸取 20μl，进样，记录 60min 的色谱图（见图 1），以西红花苷-Ⅰ的保留时间和峰面积积分值为 1，计算相对保留时间和峰面积积分值的比值2.4.4 实验方法考察2.4.4.1 标准曲线制备 分别精密吸取西红花苷-Ⅰ标准液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml 于 1ml 容量瓶中，西红花苷-Ⅱ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml 于 2ml 容量瓶中，西红花苷-Ⅲ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml 于 2ml 容量瓶中，西红花苷-Ⅳ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml 于 2ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀各浓度进样 20μl，按色谱条件测得峰面积积分值以峰面积为纵坐标，进样量（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。
见表 4表 4 西红花苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准曲线制备标准曲线的回归方程：西红花苷-Ⅰ：Y=45.443X+66.54,r=0.9996（n=5）,西红花苷-Ⅱ：Y=188.53X+425.37,r=0.9999（n=5），西红花苷-Ⅲ：Y=6.6685X-10.67,r=0.9998（n=5）,西红花苷-Ⅳ：Y=0.5635X-0.51,r=0.9996（n=5）2.4.4.2 各批次药材含量测定 见表 5表 5 各批次药材含量测定2.4.4.3 标准品及药材精密度实验 见表 6标准液：取西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品用甲醇制成 0.02mg/ml 标准液表 6 标准品精密度实验2.4.4.4 稳定性实验 取同一批西红花药材，按 2.1.1 方法制备样品液，分别在 0、2、4、6、8h 检测指纹图谱，结果各峰峰面积积分值比值的 RSD 在0.38%～1.93%之间，相对保留时间差别在 0.01～0.81min2.4.4.5 重现性实验 取同一批西红花药材，按 2.1.1 方法制备样品液，平行操作制备 5 份，分别检测指纹图谱，结果各峰峰面积积分值比值的 RSD 在3.17%～3.59%之间，相对保留时间差别在 0.01～0.81min。
2.4.4.6 加样回收率实验 精密吸取批号 20051102-03-1 药材 1ml，加入标准液西红花苷-Ⅰ0.5ml,至 10ml 容量瓶，甲醇稀释至刻度进样 20μl见表 7表 7 加样回收率实验2.4.5 实验结果 2.4.5.1 指纹图谱 测得十批西红花药材的指纹图谱见图 1，标定共有峰9 个，其中包括作为参照峰的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰（3、4）见图 22.4.5.2 共有指纹峰的保留时间和峰面积积分值 见表 8表 8 共有指纹峰的保留时间和峰面积积分值3 讨论本文采用分光光度法测定药材总苷的含量，其精密度、稳定性和重现性均符合要求，因而作为药材质量初步考察标准，此法快速、简便、准确经过对 10 批西红花药材进行测定，制订了指纹图谱检测标准及相应的技术参数，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ性质稳定，可以作为定性、定量的参照物本文对流动相进行了优化， 选择了甲醇-0.01mol/L 磷酸二氢铵（47:53）分离度较好，柱温的稳定使结果稳定性得到进一步保障方法学考察实验结果证明该方法准确可靠，可用于西红花药材指纹图谱测定本文采用了计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件，提高了数据处理的精度，简化了繁琐的算法，但软件系统尚属摸索阶段，界面不够人性化，数据转换较麻烦，有待于进一步完善。
参考文献】1 江苏新医学院编.中药大词典，下册.上海：上海人民卫生出版社，1977，2671.2 周素娣，周锦祥.国产西红花化学成分的研究.中草药，1997，28（12）：715-716.。