复合垂直潜流人工湿地中硝化和反硝化细菌的筛选及其特性分析 张成龙 李冰 侯诒然 封功成 陶冶 朱健Summary：【目的】通过在复合垂直潜流人工湿地系统中筛选高效的硝化细菌和反硝化细菌，以降低氮素污染对养殖水域生态系统的危害，为加强人工湿地氮素净化功能提供科技支撑方法】在复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统的不同运行阶段采集样品，利用选择性培养基定向筛选，选择一株高效硝化细菌和一株高效反硝化细菌，对其进行菌种鉴定，并分别研究对应菌株的硝化特性或反硝化特性结果】通过个体形态特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA同源性比对分析，确定硝化菌株ZX2属于不动杆菌属（Acinetobacter），反硝化菌株ZF7属于假单胞菌属（Pseudomonas）在pH为7.0，温度为30 ℃，亚硝酸钠浓度为0.8 g/L的条件下硝化菌株ZX2的硝化能力最强，OD600可达0.80以上，硝化速率达68.4 mg/（L·d）在pH为7.0，温度为35 ℃，接种量为6%的条件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最强，OD600可达1.00以上，脱氮率达94.5%结论】筛选得到的硝化细菌和反硝化细菌具有很好的氮素净化效果，可为下一步强化人工湿地氮素净化功能提供备用菌株。
Key： 人工湿地;硝化细菌;反硝化细菌;氮素污染;含氮废水净化： S182 文獻标志码： A ：2095-1191（2019）04-0736-09Abstract：【Objective】A high-efficiency nitrifying bacteria and denitrifying bacteria was screened in the integrated vertical subsurface flow constructed wetlands system to reduce the harm of nitrogen pollution to the aquaculture water ecosystem， and provided a theoretical basis for strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.【Method】Samples were collected at different operational stages of the integrated vertical subsurface flow constructed wetland-pond recirculating aquaculture system. A selective media was used for targeted screening，then a high-efficiency nitrifying bacteria and a highly efficient denitrifying bacteria were selected for strain identification and studying separately the nitrification or denitrification characteristics of the corresponding strain. 【Result】The nitrifying strain ZX2 was initially identified as Acinetobacter and the denitrifying strain ZF7 was Pseudomonas based on its morphological observation， physio-logical and biochemical tests as well as 16S rDNA phylogenetic analysis. The nitrification ability of nitrifying strain ZX2 was the highest under the conditions of pH 7.0， temperature 30 ℃，and sodium nitrite concentration 0.8 g/L. OD600 value could reach above 0.80，and the nitrification rate reached 68.4 mg/（L·d）. Under the conditions of pH 7， temperature 35 ℃， the inoculum amount 6%，the denitrification capacity of denitrifying strain ZF7 was the highest. OD600 value could reach above 1.00， and the denitrification rate reached 94.5%. 【Conclusion】The nitrifying bacteria and denitrifying bacteria screened in this study have good effect on nitrogen purification， and can provide a spare strain for further strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.Key words： constructed wetland; nitrifying bacteria; denitrifying bacteria;nitrogen pollution; nitrogen-containing wastewater purification0 引言【研究意义】发展高密度养殖和集约化管理是我国水产养殖业的发展趋势，高密度集约化养殖在促进渔业增效和渔民增收的同时，不可避免地带来养殖水环境污染问题。
在水产养殖过程中，鱼类排泄物和未被消耗饲料的降解使得养殖水体中的氨氮剧增，氨氮和亚硝酸氮含量过高会对水产养殖动物产生毒害作用，甚至导致大规模死亡现象发生;此外，未经处理的养殖废水排放到自然水体中也会造成富营养化，严重影响水产养殖业的绿色可持续发展（梁新雪，2011;刘国锋等，2018）因此，解决高密度水产养殖废水的净化问题迫在眉睫前人研究进展】目前水产养殖业中氮素净化应用较广泛的技术是微生物处理技术和生态处理技术微生物处理技术是利用硝化或反硝化能力强的微生物对水产养殖废水进行净化，具有氮素净化作用的微生物主要有硝化细菌（王薇等，2007）、红球菌属（张艳等，2007）、产碱杆菌属（王弘宇等，2009）、固氮弧菌属（王小菊等，2013）、假单胞菌属（杨浩锋等，2014）、不动杆菌属（颜薇芝等，2017）等，但该技术在处理效果、处理成本、推广适用性等方面尚有待进一步探究在生态处理技术方面，已有研究表明人工湿地中存在相当数量与氮素净化相关的菌种（雷旭等，2015），且硝化细菌和反硝化细菌分布状况在一定程度上受湿地结构和湿地植物的影響（王爱平等，2010）;研究显示，表面流人工湿地（鲁敏等，2012）、水平潜流人工湿地（李宝华等，2013）及垂直潜流人工湿地（董玉峰，2014）对水体中的氮磷、重金属等有较稳定的处理能力，但随着使用年限的增长，人工湿地的净化效率和稳定性必然会下降（尹炜等，2004）。
本研究切入点】复合垂直潜流人工湿地作为生态处理技术的一种典型应用模式，其对于水产养殖废水氮素的去除效果明显（董玉峰，2014）微生物的硝化和反硝化作用是去除氮素的最主要途径（张鸿等，1999），目前研究报道具有氮素净化作用的微生物种类较多，但关于复合垂直潜流人工湿地中硝化和反硝化细菌的筛选、鉴定及其特性分析的研究鲜见报道拟解决的关键问题】通过特定生境下硝化及反硝化细菌的筛选、鉴定、分析及应用，实现人工湿地氮素处理效率的提升，以期为加强人工湿地氮素净化功能提供技术支撑1 材料与方法1. 1 试验地点及概况1. 1. 1 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构 试验地点位于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心大浦科研试验基地复合垂直潜流人工湿地主要由5个单元构成，即沉淀池、上行垂直潜流湿地、下行垂直潜流湿地、预警池及清水池，面积约600 m2湿地基质为直径8～10 cm大鹅卵石、4～6 cm小鹅卵石和2～4 cm生物陶粒湿地植物为生长周期较长的梭鱼草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata），上行池主要种植再力花，下行池种植梭鱼草，再力花株距60 cm，梭鱼草株距40 cm，种植时间为5月初。
池塘养殖鲫鱼、团头鲂、鲢鱼和鳙鱼，密度依次为0.011、0.136、0.020和0.006 kg/m3，每天上午9：00—10：00和下午16：00—17：00投喂饲料试验于2017年湿地运行的6—10月进行复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统结构如图1所示1. 1. 2 复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据 人工湿地水力负荷（HLR）和水力停留时间（HRT）根据公式计算得出式中，S为人工湿地主体面积（m2），W为污水设计流量（100 m3/d），γ为人工湿地孔隙度（%），h为人工湿地深度（m）复合垂直潜流人工湿地—池塘循环水养殖系统基本数据见表1，不同时间段的人工湿地温度、pH和溶氧量见表21. 2 样品采集及培养基制备1. 2. 1 样品采集 在湿地运行初期（6月底）、中期（8月底）和末期（10月底），采用三点取样法在上行池和下行池进行采样，分别采集湿地植物根系、根系附近基质及植物附近水样，每个取样点选取3株相邻植株进行平行取样，装入取样袋，置于4 ℃环境中冷藏待用1. 2. 2 培养基制备 硝化液体富集培养基：亚硝酸钠1.0 g、硫酸镁0.5 g、碳酸钠1.0 g和硫酸亚铁0.4 g，加蒸馏水定容至l L。
该培养液在灭菌前用氢氧化钠调pH至7.5～8.0，再加0.5 g磷酸氢钾（磷酸盐单独灭菌，且在培养液冷却至室温后加入）（王小菊等，2013）反硝化液体富集培养基：硝酸钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸氢钾0.5 g和酒石酸钾钠20.0 g，加蒸馏水定容至1 L;pH 7.0～7.5（曾庆武等，2008）平板分离培养基：在富集培养基中加入约1.8%琼脂糖即可纯化培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g和氯化钠10.0 g，加水定容至1 L;氢氧化钠调pH至7.01. 3 试验方法1. 3. 1 细菌筛选 取湿地水样10 mL、基质若干及适量植物根系加入到含100 mL灭菌蒸馏水的250 mL三角烧瓶中，30 ℃下170 r/min振荡30 min后，取10 mL上清液加入到含100 mL硝化液体培养基的250 mL三角瓶中，另取10 mL上清液加入到含100 mL反硝化液体培养基的250 mL三角瓶中（夏辉和梁运祥，2006）;在30 ℃、170 r/min条件下，硝化培养液振荡富集培养10 d（每2 d吸取适量硝化富集液，在白瓷板上与二苯胺试剂发生显色反应，根据显色反应判断液体培养基中亚硝酸根的减少和硝酸根的生成状况）（胡朝松等，2009），反硝化培养液静置密闭富集培养3 d。
选取颜色变深的硝化培养液和富集培养3 d后的反硝化培养液按稀释分离方法稀释至10-2、10-3和10-4 3个稀释度，分别在硝化细菌和反硝化细菌固体培养基上涂布分。