拼接和修复操作流程一 ：拼接1、引物登记： 新引物到时，认真核对引物条数，按照基因名详细记录在引物登记本上2、溶引物： 将引物按顺序隔排排放到96孔平板上，（注意将GR基因两条重复的首尾引物各取出一条）向每管引物中加入300ul1*TE，并在每管管盖上标记出基因名称和引物序列号，注意不要错标测序引物单独拿出来，交由测序人员保存，用时再溶解3、振引物： 将每板引物用涡旋震荡器震荡均匀，每板引物震荡时间不少于2分钟4、写拼接方案： 根据每条基因的引物条数对其进行分段，每段引物在12-18条之间，标示出各段的基因长度，并依据基因的平均Tm值以及GC%选择一个合适的 退火温度一般退火温度稍高于平均Tm值，并根据GC%进行调整若GC%大于60%时，要适量加入DMSO，最后写好基因的重叠延伸方案5、混引物： 按照拼接方案的分段方法，对各段引物进行混合，每条引物取5ul混合于1.5ml离心管中，充分震荡，混合均匀6、准备反应： 找到各段的首尾引物，按顺序与混合引物排列好，准备好一管灭菌水和总管总管配置方法如下： 5*pfu Buffer 10ul * 40 400ul pfu DNA 聚合酶 0.6ul 24ul dNTP 1ul 40ul H2O 13.4ul 540ul 注意配置总管是要确保每个成分的质量，每次新领取的成分用之前要检测。
7、预扩增反应： 反应体系如下： 反应程序下： 混合引物 3ul 1、 94℃ 2min 2、 94℃ 20s 3、 退火温度+4℃ 20s 总管 25ul 4、 72℃ 14s H2O 22ul 5、 94℃ 20s 6、 退火温度 20s 7、72℃ 14s - 8、 94℃ 20s 9、 55/60/65 20s 10、 72℃ 14s 11、 72℃ 2min注意：配好反应体系后要离心，确保PCR管中没有气泡。
如有气泡会影响Pfu 酶的活性其中2-4号程序是个降落PCR（Touch down PCR）每个循环退火温度下降1度，运行4循环，5-7号程序,运行8个循环，8-10号程序，运行8个循环其中延伸温度根据片段大小决定，pfu的聚合速度为1kb/30s8、二次扩增反应： 反应体系如下： 反应程序如下： 预扩产物 1ul 1、 94℃ 2min 首引物 2ul 2、 94℃ 20s 尾引物 2ul 3、 55/60/65 20s 总管 25ul 4、 72℃ 视片段大小设定 H2O 20ul 5、 72℃ 2min2-4号程序，运行18个循环9、二扩产物检测： 取2ul二扩产物进行电泳检测，若二扩产物有很好的纯度和浓度，可直接用其做模板进行下一步的重叠延伸。
若二扩产物纯度不够，则需要对其进行胶回收，回收完后做模板若二扩产物浓度不够但很单一则需检测其首位引物的浓度若二扩产物浓度及纯度都不好则考虑更改拼接方案对拼接好的片段作好标记，对不理想的片段作好记录10、第一轮重叠延伸： 反应体系如下： 反应程序如下： 预扩产物1/2 各1ul 1、 94℃ 2min 首引物 2ul 2、 94℃ 20s 尾引物 2ul 3、 55/60/65 20s 总管 25ul 4、 72℃ 视片段大小设定- H2O 19ul 5、 72℃ 2min2-4号程序，运行18个循环11、对重叠延伸产物跑回收胶，对其电泳情况进行记录，对好的片段进行胶回收。
12、以回收好的第一轮重叠延伸产物为模板，做下一轮重叠延伸，直至得到全长二：基因修复 1.基因修复的过程：（1） 一般早上9：30－10：30之间，办公室下修复方案修复方案下后，首先用修复方案本（不用修复本，因为在将方案誊写至修复本上时有一定出错率，直接用修复方案本可以保证不拿错质粒等）找到所需的原始质粒和所需基因的引物板放于自己实验桌上然后将方案誊写于修复本上（注意写好片段大小）2） 将原始质粒稀释20倍首先写好稀释质粒EP管的编号（标明1：20）（原始质粒一般用mark笔的粗头写，所以我们稀释质粒最好用mark笔的细头写，以便区分）然后分别吸取原始质粒2uL至对应空管中，再加入38uL的无菌水（水要将原始质粒冲至管底）最后在振荡器上振荡一下3） 利用修复本将首尾引物排好顺序,至于板上然后将稀释质粒相应的排好（同时核对是否出错）写好PCR管，相应把引物和质粒加于相应PCR管中（稀释质粒、首末端引物各2mL）加入25uL的总管最后用无菌水将其配成50uL体系4） 上PCR仪：因为各台PCR仪功效不一样，运行时间长短可能悬殊比较大所以尽量一批PCR都在一台机器上运行(一些难做的基因除外）。
其GC％在40％和60%之间的可以直接用60度退火；GC％在60％左右的片段，可以加入1uLDMSO（DMSO毒性极低，是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，减少DNA的二级结构，降低退火温度）在60度上退火，或直接在65度上退火；GC％在65％或更高一点的片段，可以加入2uL的DMSO在60度上退火，或加入1uLDMSO在65度上退火；对于GC％达到75％左右的基因可以加入2/3uLDMSO（DMSO最多可加至3uL，再多的量将逐渐抑制反应）在68度或65度上退火，有些基因甚至可以用70度或72度退火；GC%在40％或更低的片段，可以在55度上退火，有些更低GC％的，可以至50度退火新pfu酶活性为每30S合成1kb片段，据此，设置延伸时间程序是1 94度 2min2 94度 20s3 设定的退火温度值 20s4 72度 13s5 72度 3min2至4号程序跑18个循环（5） 胶回收：在PCR产物下来之前须注意一下是否有回收胶PCR产物下来后在板上排好顺序，加入一点loading buffer，拿好胶，进行点样点样时尽量减少损失在胶跑好前，写好2mL的EP管。
胶跑好后，核对片段大小，割胶（胶需割得较薄，以保证没有杂带混入）；加入450uL的溶胶液（即使胶非常厚45mL已经足够，加入过多的溶胶液，在下面的步骤中容易引起污染）放入63度下水浴；写好套管和1.5mLEP管并排序（注意不能写错管子和弄错顺序）；在观察胶已溶好后，将其转至套管中，并其按顺序排在离心机上；3000r/min（相对于5000r/min其更利于DNA的吸附），1分钟；10000r/min，30S（很关键，时间太短可能会导致DNA中残留溶胶液，影响测序反应，时间太长可能导致少量DNA损失）；倒掉溶胶液，加入漂洗液，5000r/min，1min；倒掉，再漂洗一次；倒掉漂洗液后，10000r/min，1min(关键步骤，时间太短会引起酒精残留，影响后续实验）；将套管转至1.5mL的管中，放入烘箱，3－4min；取出，加入30uLTE（加至管底，而不是打在管壁上）6） 继续做下一轮PCR，直至得到所需基因全长7） 模板、原始质粒、稀释质粒和修复引物的整理：原始质粒用已写上日期的小袋装好，放于冰箱中；稀释质粒和模板按照日期排序于96孔板上，约一个月以前的东西整理倒袋子中这样只要查一下修复本和修复方案本就可以迅速找到所需东西。
一般一个月内的东西十分钟内能找到，一个月以前的东西半小时内能找到8） 基因进度整理：修复方案本上的方案在其被誊写到修复本上时，在此方案前打勾，在此方案被完成后，用红笔在其右侧标上连接编号和日期（以保证没有漏做的基因）每天中午时候观察平板生长情况，如遇不好情况，采取相应措施；对于难做的基因尽量多花时间，尽快做完，从而不影响基因的整体进度一般的修复方案尽量在当天就完成，最迟第二天，必须完成2. 修复中可能出现的问题以及注意事项（1） 看胶时出现一系列异常情况：所有片段都没有出，或只有个别片段有很弱的带，说明总管有问题，或个人实验中出错；一条基因的全部片段都没有出，可能是原始质粒拿错，或退火温度不对；一条基因的部分片段没出，说明此基因的部分引物不好、原始质粒（。