细菌鞭毛染色及活细菌的运动性观察细菌鞭毛染色及活细菌的运动性观察摘要：生长在某些细菌表面的纤细丝状运动器官，称为鞭毛采用硝酸银染色法对枯草杆菌和铜绿假单胞菌进行鞭毛染色，在光学显微镜下观察菌体形态和菌毛的长短、数量、着生位置，得到清晰的结果采用压滴法观察活细菌的运动性，对其运动情况有初步了解关键词：鞭毛染色 硝酸银染色法 压滴法 活细菌1前言1.1实验目的1.学习并掌握鞭毛染色法，观察鞭毛的形态特征2.学习用压滴法观察活细菌的运动性1.2实验原理鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标鞭毛直径一般为10~30nm,只有用电镜才能直接观察到若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difo氏染色法）进行染色本实验采用的是硝酸银染色法在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强．细菌和周围的液体难以区分。
2材料与方法2.1实验器材2.1.1菌种枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单胞菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物2.1.2溶液和试剂硝酸银鞭毛染液，0.01%美兰水溶液，香柏油，二甲苯，体积分数95%的乙醇2.1.3仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，擦镜纸，接种环，镊子，记号笔，滴管和无菌水等2.2实验步骤2.2.1压滴法步骤内容备注1涂片：在洁净的载玻片中间滴加一滴无菌水，挑取一环枯草杆菌液与水棍合取菌的操作应在酒精灯附近进行2滴加一滴0.01﹪美兰水溶液，混匀染液不要滴加太多3加盖玻片：用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后缓缓地放下盖玻片，防止产生气泡4迅速镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到标本,再用高倍镜观察，也可用油镜观察注意区分细菌的鞭毛运动和水的流动，后者细菌的位移朝同一方向，只有细菌有明显位移且方向不同时，才能判定为有运动性2.2.2鞭毛染色（硝酸银染色法）步骤内容备注1清洗玻片：将载玻片用去污粉清洗干净后，置于95﹪乙醇中浸泡5分钟，然后取出在酒精灯火焰上烧去酒精及可能残留的油迹2涂片：在洁净的载玻片中一端滴加一滴无菌水，用接种环挑取一环菌种，与水混合均匀。
立即倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水纸吸去多余菌悬液，自然干燥取菌后的接种环在玻片的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力过猛，更不能将接种环大幅度涂开，以免鞭毛脱落3染色：①滴加硝酸银染液A液，染3~5分钟；②用蒸馏水充分洗去A液；③用硝酸银染液B洗去残水后，再滴加B液覆盖菌面30~40s，可用酒精灯微火稍微加热至菌面显褐色；④立即用蒸馏水冲洗，自然干燥A染液染3~5分钟后，用蒸馏水冲洗是要充分，以免背景很脏，鞭毛不易被观察到4镜检：先低倍，后高倍，最后用油镜观察3结果与分析3.1压滴法 用压滴法观察枯草杆菌的运动性，盖上盖玻片立即观察时，可以看到浅蓝色的细菌细胞盖玻片下里液体流动较明显，菌体随水流运动，运动方向较统一且呈直线状待液体稍蒸发，盖玻片下液体充分但不流动时观察，细菌的运动朝不同的方向，运动过程中可转弯；有些细菌在原地左右摆动，应为布朗运动压滴法检查细菌的运动性来判断鞭毛的有无快速、简洁，但受操作和滴加美兰试剂的量影响较大3.2鞭毛染色实验结果（见下表，附图）鞭毛染色实验结果菌种菌体颜色菌体形态鞭毛颜色鞭毛分布鞭毛数量枯草杆菌深褐色杆状，单生或形成短链褐色菌体细胞表面，为周生鞭毛很多根铜绿假单胞菌深褐色直或稍弯，两端钝圆的杆菌，单生浅褐色菌体的一端，为端生鞭毛1~3根 图1 鞭毛染色后的枯草杆菌标准菌（10×100） 图2 鞭毛染色后的铜绿假单胞杆菌标准菌（10×100）3.3实验分析细菌鞭毛染色的影响因素很多，主要在于以下方面：1）菌种的选择：细菌的鞭毛应多而长，易于观察，另外要选取活跃生长期的菌种进行鞭毛染色，老龄菌体活动度降低，鞭毛易脱落。
2）载波片的洁净程度：载玻片必须清洁、光滑、无油迹，否则菌液不能散开，造成菌体堆积，鞭毛相互纠缠而难以看清，而且染色后背景脏乱3）制片过程中条件要温和，不能剧烈震荡、涂抹菌液，可以用酒精灯微火稍微固定，但必须保证温度不要过高，以免菌毛脱落4）染液的新鲜程度：A染液和B染液最好都先用现配，搁置一段时间的染色液染色效果较差5）硝酸银染液B液染色时间的掌握是本实验能否成功的关键环节3.4思考题1.除鞭毛染色法外，还有什么方法能观察到鞭毛？还可以用把细菌做成装片，在电子显微镜下观察2.如果你发现鞭毛已于菌体脱落，请解释原因 鞭毛与菌体脱落，可能有以下原因：①细菌的菌龄较老，活动度降低，鞭毛易脱落；②涂片时，接种环在玻片的蒸馏水中用力过大；③用酒精灯微火固定时温度过高；④冲洗染液时水流过大，造成鞭毛脱落参考文献1.沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.76-80页3。