中山大学博士学位论文转IGF-I基因软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究姓名：黄建荣申请学位级别：博士专业：外科学（骨外科）指导教师：刘尚礼2003.4.23转I G F ．I 基区I 软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究导师：刘尚礼教授博士生：黄建荣转I G F - I 基因软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究专业：外科学 博士生：黄建荣导师：刘尚礼教授中文摘要， l 随着社会的发展，交通事故日夜增多；人口老龄化的趋势也越来越明显，因而，关节软骨缺损的病人会越来越多但关节软骨缺损后自身是不能修复的，这主要取决于关节软骨的特殊结构透明软骨组织由软骨细胞外基质和包裹在软骨陷窝内的软骨细胞组成，软骨组织损伤后，包裹在基质陷窝内的软骨细胞不能迁移到缺损部位参与修复；对于穿透软骨下骨板的软骨缺损，从骨髓中游离出来的、具有成软骨潜能的间充质干细胞可能参与修复，但在自然的关节环境中，间充质于细胞一般不能自动向软骨细胞分化这些就是造成软骨缺损不能自我修复的主要原因针对关节软骨缺损，目前传统的治疗方法主要是刺激关节软骨的自身修复，包括清创灌洗法、软骨下骨钻孔术( s u b c h o n d r Md r i l l i n g ) 、打磨术( a b r a s i o n ) 及微骨折法( m i c r o f r a c t u r e ) 等。
目的是促进具有成软骨潜能的骨髓间充质干细胞参与修复其修复组织是由成纤维细胞、软骨细胞和无序排列的细胞外基质共同组成的纤维软骨修复的纤维软骨没有正常透明软骨的生物力学性能和粘弹性，远期疗效差另一类为组织细胞移植方法组织细胞移植包括软骨移植、骨膜／软骨膜移植和细胞移植骨膜、软骨膜移植后可生成透明软骨样组织，但其生物力学性能、耐磨持久性不佳，易退变，而且依靠的是前体细胞向软骨细胞的分化，前体细胞具有多向分化潜能，可分化成脂肪细胞、成骨细胞等，从而使新生组织性能不佳关节软骨移植是用整块的正常关节软骨植入缺损区，以提供产生软骨基质的活软骨细胞但自体软骨来源有限；供区与受区形状难以匹配；植入体内后难以形成精确的三维结构；移植软骨和宿主软骨不能有效整合；同时造成供区的软骨缺损，供区与周围正常软骨间的纤维连结在长期活动中易磨损而影响关节功能；异体软骨移植更由于磨损暴露区的异体抗原易引起免疫反应，导致移植失中山大学博士学位论文转I G F —I 基因软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究败自体软骨细胞移植自1 9 8 7 年开始应用于临床P e t e r s o n 报告了1 0 1 例应用自体软骨缅胞移植治疗大面积全厚关节软骨缺损的随访结果：单纯孤立性股骨髁缺损组优良率达9 2 ％。
新生组织活检证实为透明样软骨，免疫组化发现I I 型胶原染色阳性部分病例随访9 年，新生组织仍呈透明软骨样外观自体软骨细胞移植要求将自体软骨细胞在较短时间内( 3 周内) 体外扩增获得大量的软骨细胞，才能在缺损区形成透明软骨，但自体软骨细胞来源有限，体外多次传代培养容易使软骨细胞发生“去分化”，即向成纤维细胞分化，所以难以由少量软骨组织经体外扩增来获得大量具有正常功能的软骨细胞因此，寻求一种软骨细胞体外快速扩增且保持其表型稳定的方法是目前急需解决的关键问题之一软骨细胞在体外单层培养的过程中容易发生表型改变的可能原因之一是失去了细胞与细胞之间、细胞与基质之间的信号转导，将细胞与生物材料粘附的三维培养是阻止细胞去分化的有效途径之一可用于三维培养的支架材料很多，有胶原纤维、纤维蛋白、P L A 、P G A 、透明质酸等以P L A 、P G A 为代表的人工合成材料亲水性差，对细胞的粘附性能不佳：以胶原纤维、纤维蛋白为代表的天然材料亲水性太强，强度差，水合后容易失去原有形态，并在体内吸收太快透明质酸( H y a l u r o n i ca c i d ，H A ) 为一种直链高分子聚合体，兼具合成材料与天然材料的优点。
它能体外合成，来源广泛；与软骨细胞的亲和力强，有较强的亲水性和粘附性；最近的研究表明，透明质酸还具有促进细胞生长分化及迁移的功能然而，透明质酸水溶性太强，在体内降解速度过快，作为细胞支架材料的功能受到限制如果能够改变透明质酸的水溶性和体内降解速度，使之符合软骨支架材料的要求，透明质酸无疑将成为最佳的细胞支架材料之一软骨细胞的增殖、分化及基质合成能力直接影响关节软骨的功能状态及损伤后的修复关节软骨、软骨下骨中存在着多种生长因子，并且软骨细胞本身具有合成多种生长因子及表达相应受体的功能它们与细胞因予、激素形成一个精密的网络调节系统，通过自分泌、旁分泌的方式，在时间及空闻上相互作用，调控软骨细胞生长、发育及损伤后的修复目前研究中的重要的生长因子包括胰岛素样生长因子( i n s u l i n —l i k eg r o w t hf a c t o r s ，I G F s ) 、转化生长因子．0 、成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白等I G F - I 是一种由7 0 个氨基酸组成的多肽，分子量为7 ．6 k D a ，其结构与胰岛Ⅱ壁! 里! ：! 苎塑鉴量型望壁堕塑生鲞羔墼量竺塑堕壅鉴型[ 窒量堕! 型堂垫墼堡堕主生：茎垄茎一素同源，受生长激素调节。
它是第一个被确认对关节软骨具有自分泌调节作用的生长因子，在关节软骨中的作用有：( 1 ) 刺激细胞分裂增殖I G F —I 显著促进多种来源的软骨细胞增殖，而不影响软骨细胞的分化状态 z ) 促进蛋白多糖的合成，阻止基质金属蛋白酶的表达，减慢蛋白多糖的降解体外研究发现，在白介素一1B 和肿瘤坏死因子存在的条件下，I G F —I 仍能促进软骨细胞的蛋白多糖合成 3 )刺激Ⅱ型胶原蛋白的合成在无血清的体外培养中，I G F —I 能显著刺激Ⅱ型胶原蛋白的合成无论对于未成熟或者己分化成熟的软骨细胞，I G F —I 在促进软骨细胞合成代谢方面的作用是相似的，在生长发育期间，刺激关节表面的有控增大；在肢端肥大症患者，组织中I G F ～I 水平增高可引起成人关节软骨的肥大和增生应用I G F - I 与软骨细胞联合移植能促进缺损软骨的修复，但外源性I G F —l 半衰期短，需大剂量反复使用，而且价格昂贵研究表明，利用转基因技术将生长因子基因转入种子细胞后可在局部缺损区持续高表达具有生物活性的内源性生长因子，调控其自身的增殖与分化将含有I G F 一1 基因的腺病毒载体直接注射到兔膝关节腔内，关节灌洗液中I G F —l 的表达水平明显升高，但这种在体基因转染方式不能确定基因是否转染软骨细胞，更不能确定转基因细胞的生物学作用。
将I G F —I 基因转入软骨细胞，体外研究比较转基因软骨细胞的生物学行为，再将转、 基因细胞移植体内，更能为软骨组织工程的研究提供可靠的实验依据火 彳＼支’，、印殆} 食：第一部分：I G F —I 与H A 联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响目的：探讨胰岛素样生长因子一I ( I G F —I ) 和透明质酸( H A ) 联合培养对人关节软骨细胞增殖及其生物学行为的影响防法：分离培养人关节软骨细胞，将相同数量的第3 代软骨细胞分为3 组，分别加入不同浓度的I G F —I 、H A 、I G F —I和H A ，用四氮甲基唑蓝法( M T T ) 和流式细胞术测定不同时间点软骨细胞增殖活性的变化从第4 代开始，用h l G F —I 和H A 联合培养，通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、I I 型胶原和a g g r e c a n 免疫组化及R T —P C R 等检测方法判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化自然传代的第6 代细胞为对照组结果：I G F ～I 在1 0n g ／m l 的浓度时即可明显促进软骨细胞的增殖，当I G F - I 浓度为5 0n g ／m l 时，其促增殖作用达最大值；联合应用I G F —I 与H A 在促进软骨细胞增殖的作用中具有协同效应并使促增殖作用时间后延；I G F —I 和H A 联合培养的第8 代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡；R T - P C R 显示I I 型前胶原m R N A 表达阳性而I 型前胶原m R N A 表达阴性；甲苯胺蓝染色显示细胞浆呈现明显的紫色异染反I I I中山大学博士学位论文转I G F ，I 基因软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究应：I I 型胶原和a g g r e c a n 免疫组化染色见8 0 ％一9 2 ％的细胞染色呈阳性或强阳性，平均灰度值分别为8 5 ．9 2 和1 1 6 ．2 3 ，均显著高于对照组孑结论：I G F —I 能明显促进软骨细胞的增殖；单纯应用H A 对软骨细胞的增殖无影响：二者联合培养时其促增殖能力更强，并且能有效地保持软骨细胞表型的稳定。
第二部分：I G F ．I 促进体外工程软骨形成目的：探讨胰岛素样生长因子一I 体外促进以透明质酸为支架材料的工程软骨形成的能力防法：分离培养人关节软骨细胞，分为3 组：①单纯透明质酸＼ 材料( 材料组) ：②透明质酸材料+ 软骨细胞( 细胞组) ③透明质酸材料+ 软骨细胞+ I G F —I ( I G F —I 组) 各组在D M E M 中培养一定时间后，在不同时间点，取体外培养的组织块，通过H E 染色判断培养组织的形态，通过I I 型胶原免疫组织化学及I 、I I 型胶原R T —P C R 判断体外培养物的成软骨能力结果：单纯透明质酸材料组不能形成软骨组织：细胞组和I G F —I 组在第6 周均能形成典型的软骨组织陷窝，但细胞组的陷窝数量明显低于I G F —I 组；I I 型胶原免疫组化示I G F —I组阳性强于单纯细胞组；R T —P C R 示I G F —I 组的I I 型前胶原表达量明显高于细胞组，而I 型前胶原的表达量明显低于细胞组说明I G F - I 组的软骨基质构成更接近于正常软骨彳结论：I G F —I 能促进体外工程软骨的形成，改善体外工程软骨的f质量。
第三部分：I G F - I 基因转染人关节软骨细胞及其在软骨细胞中的表达目的：探讨I G F —I 基因转染人关节软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化方法：构建p c D N A 3 ．卜I G F —I ／G S ＼ 质粒，将构建质粒在大肠杆菌D H I O B 中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定；将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染入关节软骨细胞，通过R T —P C R 、W e s t r e n —b l o t 等方法检测I G F —I 基因在人关节软骨细胞中的表达；分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，在紫外分光光度计下检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的P G 含量结果：质粒抽提纯化后电泳可见3 条D N A 条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和I G F —I基因序列完全吻合；质粒转染软骨细胞后，R T —P C R 能见到2 9 8b p 的I G F —Im R N A片断的表达；Ⅳe s t e r n —b l o t 可见7 ，6K D a 的I G F - I 蛋白表达条带；转基因软骨I V转1 0 F ．I 基因软骨细胞移植治疗关节软骨缺损的实验研究导师：刘尚礼教授博士生：黄建荣细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的P G 含量分别是5 ．2 3ug ／m l 和2 ．4 7pg ／m 1 ，二者比较差异有显著意义，p O0 5 ；4 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lI I ，q = 3 ．9 1P I G F —I I > 胰岛素。
I G F —I 和I G F —I I 都是通过与I G F - I R 结合而对细胞增殖和分化起调节。