光学分析法-2讲解

第二章 双波长分光光度法与导数光谱法 单波长分光光度法 物质对紫 外-可见 辐射有选 择的吸收 分光光度法 单波长双光束分光光度计原理 双光束 分光光 度计 把来自单色器的单色光,通过旋转镜和 反光镜转变为分时空交替照射到参比光 路和样品光路的两光束,然后这两光束 又分时交替地照射到同一检测器上. 原理 把 来自光源的光束经单色器色散后,分离出所需要的单色光() ,经反射镜(M1)分解为两束强度相同的光束(I0),分别通过样品池 (S)和参比池(R) 后成为IS 和IR,这两束光在平面反射镜M3和M4 的作用下,重新汇合为同一方向后投射到光电倍增管上. 单波长双光束分光光度计原理示意图 单波长分光光度法定量分析的理论基础 n参比光路:AR=log(I0/IR)=abc0 n样品光路：As=log(I0/IS)=abcs n输出信号为：△A=AS-AR=log(IR/IS)=ab△c 式中： b-吸收池长度（cm） na-吸收系数，与波长有关 nC0-参比液中试剂空白 Cs-试样溶液中含待测物浓度 传统的单波长分光光度法的局限性 1.多组分的测定(光谱相互重叠,相互干扰) 2.复杂样品(参比难寻) 3.测定混合样品中低含量的组分 单波长分光光度法 双波长分光光度法  双波长分光光度法的工作原理 原理:从光源发射出来的光 束,分别经过两个可调节的 单色器,得到两束不同波长 的单色光,利用斩光器,使两 束光分别交替地照射到同一 个吸收池上,然后光电倍增 管交替地接收到通过样品池 的信号,再经过电子线路装 置转换为它们的吸光度差 ΔA. A1=-log =a 1 bc+As` 在2处有关系式： A2=-log =a 2 bc+As`` 上式中a1 ，a2为待测物在1和2的吸收系数， As`,As``为光散射或背景吸收. -log(I2/I1)= A2 -A 1 =A=( a 2 -a 1 )bc+(A s``1 -As`) 设开始时使交替照射的两道单色光1(为参比波长)和2(测量 波长)的强度都为I0,那么在1处有关系式： I1 I0 I2 I0 如果选择合适的波长使As`A s``，通过吸收池的两道光束 的光信号差： -log = A2 -A1=A I2 I1 A=( a2 -a1)bc 双波长测定方法-（1）等吸收点法 n等吸收点:指在某一波长上的吸光度 不随浓度的变化而发生改变. n如果吸光物质在不同浓度的吸收曲线 有若干个等吸收点,可以选择其中一 个等吸收点处的波长作为参比波长（ 1），与吸收物质的吸收峰波长（2 ）组合。

n左图是用羧基偶氮胂测定镝时，由吸 收曲线确定合适的波长对（ 1 =590nm,2 =660nm) n吸收线1-5分别含镝1，2，3，4，5 g. （2）无等吸收点 n被测物质没有明显等吸收 n点，可在吸收曲线另找一 n合适参比波长1，这样测 n得的A值可以扣除背景吸 n收 以配合物最大吸收峰为测量波长(2),试剂最大吸收峰作参比 波长(1),这样测得的吸光度是试剂吸收的减少和配合物吸收 增大的总和. （3）双峰双波长法 双组分的测定-（1）等吸收法 n对于双组分体系中某一组分的测定,实质上在测定任一组 分时,要选择两个合适的波长,使另一组分在这两个波长处具 有相等的吸光度,以达到消除干扰的效果. 对于含有吸收光谱相互重叠的 A,B组分来说,选择波长必须考 虑两个条件: ①.B组分在 两个波长处 的具有相同 的吸光度, 即ΔAB=0 ②.尽可能使 被测组分A在 这两个波长处 的吸光度差值 足够大. 右图为在偶氮胂Ⅲ存在下测定 偶氮胂Ⅰ(x为偶氮胂Ⅰ,y为 偶氮胂Ⅲ) 以偶氮胂Ⅰ的最大吸 收波长为测量波长(2), 在这一波长位置作一垂 直线交X轴,此直线与偶氮胂 Ⅲ的吸收曲线交于某一点P, 从P点作一条平行于X轴的 直线,与偶氮胂Ⅲ的吸收曲 线相交于Q点,选择Q的波长 为参比波长(1). 波长组合初选-作图法 扫描法--将一波长固定,另一波长通过波长扫描获得. 扫描法是以不同浓度的溶液扫描,进一步验证组分浓度改 变时是否可能由聚合,缔合等作用而引起对吸光度差值 (ΔA)的影响. 下图是以苯酚-三氯苯酚体系扫描法选定波长示意图,选定苯 酚的吸收波长270 nm作为测定波长2, 然后固定苯酚浓度, 改变三氯苯酚浓度进行波长扫描,获得一系列吸收曲线,得到 另外两个等吸收点286nm和325nm,可作为参比波长1 扫描法 扫描法测定波长,2固定在270nm, 1通过扫描法确定. 1-4吸收曲线对应的三氯苯酚浓度: 10,20,30,40g/mL,R为基线. 2 270 1 1 扫描法 固定初选的测量波 长(2)不变,A 2 ΔAi= A 2i - A 1i(参比波长在初选波长 1附近以小于1.0nm 间隔变化) 配制不同浓度的干扰组分 参比波长暂定在初 选波长(1), A 1 ΔAx= 0 (2, 1x) (2, 1x,y,z) 波长组合精选法 (2, 1a) （2）系数倍率法 在共存组分没有吸收峰，这样等吸 收法就无法采用。

原理：由两道单色光（ 1和2）分 时地通过吸收池后到达光电倍增管 这两个信号经对数转换器转换成吸 光度，并分别用函数发生器加以不同 程度的放大，在差分放大器得到差示 信号S. S=K2A2 –K1A1 A2 和A1是 混合物 在2和1处吸光度 K2，K1分别在2和1的放 大系数 A1=a 1+b1， A2=a 2+b2 a 1 和a 2表示x组分在1 和2上的吸收,b 1 和b2表 示y组分1和2上的吸收, S=K2A2 –K1A1 = K2（ a2 +b2）–K1 （ a1 +b1） = (K2a2 –K1 a1) +(K2b2- K1 b1) K2b2- K1 b1=0 S =K2a2 –K1 a1 S=(K2a2` –K1 a1`)bc a2` , a1`为对应的摩尔吸光系数 系数倍率法的仪器装置示意图 光源 差分放大器 函数发生器 对数转换器 单色器 斩光器 吸收池 光电倍增管 前级放大器 脉冲信号 A1=A x1+Ay1 +Az1 A2=Ax2+Ay2 +Az2 Y,Z交于1 ,2处, 三组分测定 三组分混合物中测定X组分 ΔA = KA2 - A1 = K(A x2+Ay2 +Az2) - (Ax1+Ay1 +Az1) = (KAx2 - Ax1)+(KAy2 -Ay1)+(KAz2 - Az1) KAy2 -Ay1=0, KAz2 - Az1=0 ΔA= KAx2 - Ax1 三组分测定 双波长法的应用-（1）混浊背景的双波长法 溶液中固体微粒,如环境水样中的混浊物,生物试剂中 的细胞色素,线粒体等 混浊背景 混浊溶液因其固体颗粒大小和不同光谱区所产生的光散射强 度不同.特别在紫外区,光散射强度随波长向紫外区移动而增强 . 参比难寻 双波长法测定 特点 无双波长分光光度计 单波长分光光度计 选择测量波长(2)和参比波长(1) ΔA=A2-A1 准确度较低,手续烦琐 测定愈疮木酚-4-磺 酸钾时,可选择1 - 2波长组合,此时另 一组分在这两个波 长的吸光度差为 0.(1为愈疮木酚-4- 磺酸钾; 2为愈疮木 酚-5-磺酸钾) （2）.混合组分测定-(测定感冒剂中愈疮木 酚磺酸钾的两种异构体) 1 单组分的双峰双波长测定 应用试剂最大吸收峰为参比波长(1), 配合物最大吸收为测量波长(2) 定义 对于背景深的溶液,单波长法测量方式是以固定试剂量 作参比的,在一系列浓度中,随着浓度的增加则消耗显色 剂的量也增加,然而在整个系列中都扣除固定的显色剂 的量必然使分析校正曲线斜率下降. 不仅消除显色剂深背景的影响,而且在不 同程度上提高方法的灵敏度 原因 ①.在双峰双波长位置有最大吸光度差值 公式 n∆A= A2 –(-A1)= A2 +A1 优点 提高灵敏度原因: ②.双波长法可以提高分析校 准曲线斜率 以二甲苯胺蓝Ⅱ测定镁为例, ①.1线和3线斜率相同,仅参比 溶液不同,当1线减去固定试剂 空白的吸光度值得3线. ②.2线是以相应过剩显色剂作 参比测定结果,既1线减4可得2 线. ③.2线与3线相比,2线的斜率 大大高于3线. 1-Mg-R(水参比),2-Mg-R(相应过 剩R作参比),3-Mg-R(固定R作参 比),4-R(水参比) n∆A= a –(-b)= a +b 灵敏度提高倍数= a +b a 双波长分光光度计的基本结构 （1）.仅使用一个吸收池。

（2）.可用于混浊样品，复杂样品中特定组分的测定 （3）.信号差，不受光源电压和外部电源变化的影响 （4）.可以追踪化学反应 双波长分光光度法的特点 于存在背景吸收曲线上取R,M 和P 三点作一直线以待测物的吸收波长 （2）,另找 1 和3为校正波长，则 分析物的准确吸光度为： 式中，m为2 和3的差值；n为 1 和2的差值； 1 ，  2 和 3 分别为待测物在三个波长处 的摩尔吸光系数；C为待测物 浓度，b 吸收池厚度 三波长分光光度法的基本原理 三波长法中三个波长的选择——等吸收点法和计算法 等吸收点法 如果在干扰组分的吸收光谱上能找到三个 等吸收点,而且在此三波长处测得的待测组 分ΔA值较大. 如选择的三个波长相应于干扰物吸收曲线上三点处于 一条直线上,则测得干扰物的ΔA为0. 当干扰组分的吸收曲线 为一直线(如浑浊产生的 干扰, 右图),则在任选的 三个波长处测定,测得的 ΔA与干扰物浓度无关. 测得的ΔA只与待测 组分的浓度有关. 干扰物为一吸收曲线 (如右图), 在曲线上找到处在一条 直线上的三点,在此三点 相应的波长处测定. 干扰物在此三波长 处的ΔA为0, 导数分光光度分析 浑浊样品 测定信号被强吸收信号所淹没的弱吸收 1955年Giese等提出改进分光光度计的信号 处理系统,为处理分辨波长相近的谱线,将透光强度 对波长进行一次微分,可以得到不同高度,半宽度和 间距不同的导数光谱图. 导数分光光度法的基本原理 I0,I分别为入射光强度和透 射光强度,为摩尔吸光系数 ,b为吸收池厚度,C为待测组 分浓度.一次微分 从上式可知,I和是波长的函数,I的一阶导数值与浓度呈线性 关系,灵敏度(一阶导数值的大小)决定于摩尔吸光系数对波长 的变化率 最大时,灵敏度最大. 结论 二次微分 当 时,I的二阶导数值与浓度呈线性关系 结论 三次微分 当 时, I的二阶导数值与浓度呈线性关系 结论 四次微分 当 时, I的四阶导数值与 浓度呈线性关系 结论 具有导数光谱测量装置的分光光度计,一般将 信号作对数转换,用吸光度进行微分处理,即 A的n阶导数值始终与待测组分的浓度成正 比,且在n阶导数值最大时,灵敏度最大. 一阶导数曲 线的零点对 应于吸收曲 线的吸收峰 一阶导数 曲线的零 点对应于 吸收曲线 的吸收峰 一阶导数曲线和吸收曲线的比较 dA/d=(dA/dt)/(d/dt) 获得导数光谱的方法-（1）.电子微分 这种模拟微分电路的特点： (1) .在微分过程申，在实现信号微分的同时也实 现信号的放大，从而显著地提高了测量灵敏度，灵敏 度提高2-3个数量级。

(2).微分电路的放大与输入信号的频率有关，通过 选择不同的放大倍数，可提高分析选择性，消除低频 背景干扰 (3).导数值与待测组分浓度成线性关系，可用于定 量分析· (4).将n个模拟微分电路串联起来，就能得到n阶 导数光谱,将一般自动记录式分光光度计的主机、记录 仪及模。