1细胞分裂素检测方法的研究进展【摘要】 细胞分裂素是一类重要的植物生长调节激素，对这类激素进行超微定量检测对于揭示其在植物体内的信号转导机理、发挥其对作物生长的调控作用具有重要意义本文综述了近年来细胞分裂素各种分析方法的研究进展，包括免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学方法等，介绍了实际样品常用的前处理方法，并讨论了未来的研究发展方向 【关键词】 细胞分裂素，免疫分析法，色谱法，毛细管电泳法，样品预处理，评述1 引 言细胞分裂素(cytokinins，CTKs) 是一类重要的植物生长调节激素，在植物体内广泛参与各种生物过程CTKs 可以促进植物根部的形成，以及根部损伤的修复[1]CTKs 还影响叶绿体的制造和微结构[2]，影响植物的光合作用和病原抵抗[3]等目前, 已被确认的CTKs 有 40 余种[4], 所有的天然 CTKs 都是腺嘌呤衍生物表 1 列出了典型 CTKs 的结构、名称和简称根据其 6 位 N 原子(N6)上取代基(R1)的不同，常见的 CTKs 可分为 3 类: 异戊二烯型、异戊二烯衍生型和芳香型[4]同时，根据其 R2 的不同又可以将其分为自由2碱基型、核苷型、葡萄糖苷型和核苷酸型等。
另外还存在 3 位 N 原子或 7 位 N 原子上葡萄糖基取代的 CTKs[5]CTKs 在植物体内主要产生于 RNA 代谢过程[6] ，生物学家已经能够通过调节相关基因的表达来控制内源 CTKs 的含量[7]，但是进一步确定 CTKs 对植物生长的作用还需要准确的内源性 CTKs 定量分析方法另外，植物体内的异戊烯基腺嘌呤(iP)等 CTKs 的浓度还可以作为反映植物生长环境状况和疾病情况的标志物[8]生物测试法(bioassays) 是最早采用的 CTKs 测定方法[9] ，但是这种方法的专一性和重复性都较差，分析过程复杂、工作量大，适合作为 CTKs 的定性分析方法，为理化分析方法提供生物活性方面的依据由于 CTKs 在植物体内含量非常低(约为 pmol/g)，因此，需要高灵敏度的定量分析方法和高选择性的纯化富集样品前处理方法对其进行分析本文将从这两方面进行论述2 分析方法2.1 免疫分析方法3免疫分析方法具有高效液相色谱法(HPLC) 等仪器分析方法所不及的优势及特点：(1) 由于免疫反应的特异性，可用粗提产品直接检测，从而显著提高了测试速度;(2) 免疫分析对特殊仪器的需求较少，分析成本较低;(3) 免疫分析方法的灵敏度高。
由于这些优点，免疫分析方法一直在 CTKs 检测中广泛应用[10～21]异戊烯基腺苷(iPR) 和反式玉米素核苷(tZR) 作为免疫分析研究中的半抗原，所制得的抗体对 N6 上的取代基有较好的识别，即对于与半抗原 R1 不同的分子交叉反应较小最早用于 CTKs 测定的免疫分析方法是放射性标记的免疫分析法(RIA)[10～13]，分别实现了对 iPR 类 [10]和 ZR 类[11]CTKs 的定量检测其中 Weiler 等[11] 制备的 tZR 抗血清对 tZ 和 tZR 有高特异性，对表 1 典型细胞分裂素的结构、名称和简称 [5, 40]很小，对 tZR 的检出限达到 15 pg，线性范围在 0.02～10 ng该方法被用于西红柿果实粗提物中玉米素含量的测定Trione 等[12] 制备了抗 tZR 的单克隆抗体，并将其用于 tZR 的 RIA 检测，灵敏度达到fmol 量级由于 RIA 需要专业的放射性物质操作技术以及特殊的实验室设备，后来逐渐被更易普及和自动化的酶免疫分析(EIA)所取代[14～21]Hansen 等[14]利用抗 tZR 多抗以及碱性磷酸酯酶标记抗原建立了对 tZR 和 tZ 的检测方法，检测线性范围为 0.3～30 4pmol，同时利用这种方法测定了在玉米茎中 tZR 和 tZ 的梯度分布。
Maldiney 等[15]将生物素 亲和素体系引入 ZR 的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法，使得检出限可以达到 3～5 pg，线性范围在1～1000 pg，利用这种技术可以检测 100 mg 西红柿样品中的 ZR含量Zhao 等[16]提出了一种简化的间接竞争 ELISA 法，将抗体、竞争分子和酶标二抗在同一步中加入，可以缩短检测时间，同时在一定程度上提高了灵敏度(对 ZR 为 1.3 倍)，但该方法的试剂消耗量更大由于 CTKs 都是小分子，因此在制备抗体时需先将 CTKs 与载体蛋白(如牛血清白蛋白(BSA)，鸡卵白蛋白(OVA)等)偶联制得全抗原文献[10～20]中所采用的偶联方法都是 Erlanger 等[22]建立的核苷类分子与蛋白分子上的自由氨基共价偶联的方法(如图 1 所示) Papet 等[21]研究了 iPR 与蛋白的另一种偶联方法 ELISA 和 RIA的检测结果表明，这种偶联方法制得的多克隆抗体对 iPR 和 iP 具有专一性，与 Z 和 ZR 没有交叉反应进一步使用这种抗体制得免疫亲和吸附胶，对 iPR 的吸附容量达到 1 mg/L图 1 嘌呤核苷与蛋白的偶联方法[22]Fig.1 Conjunction of adenosine to protein[22]2.2 气相色谱法(GC)5由于 CTKs 分子挥发性较弱，无法直接用气相色谱(GC)方法来分离检测，所以对 CTKs 进行 GC 分离检测都需要先经过衍生化[23～29]。
Most 等[23]首次报道了三甲基硅烷(TMS)衍生物用于CTKs 的 GC 分离检测分别制备了 iP、玉米素、二氢玉米素、激动素及其相应核苷的衍生物制备方法为：将 iP 等化合物与双( 三甲基硅烷)乙酰胺 (BTMSA)在 60 ℃的乙腈溶液中反应 5 min衍生前样品需要经过严格的干燥虽然这种衍生方法比较简便，但由于在实际操作中难以控制 N6 上的取代反应，影响了测定结果的重现性全甲基化衍生技术由 Morris[24]和 Young[25]在 1977 年建立，首先用强碱对 CTKs 分子进行处理，处理后的产物再与碘甲烷反应虽然这种衍生方法在操作上比 TMS 法要复杂，但它具有以下优点：(1) 全甲基化衍生物更稳定，从而可以进一步用 HPLC 或其它方法纯化;(2) 形成的衍生物单一;(3) 甲基化后分子量只增加 14，而 TMS 法增加 72，分子量的大增使当时的质谱检测方法受到限制Morris 等[24]通过对全甲基化衍生物的质谱图进行分析，从长春花的组织中首次检出了天然的 ZOG 和 ZROGYoung[25]对比了一系列强碱的衍生化效果发现，二甲亚砜碳负离子有很好的效果(二甲亚砜碳负离子由特丁基锂加入二甲亚砜中制得)。
6Ludewig 等[26]报道了 CTKs 三氟乙酸衍生物的制备，这类衍生物由于具有很强的电子捕获能力，可以被电子捕获检测器(ECD)高灵敏地检测而被应用这种方法虽然灵敏度较好，但是衍生化时选择性较差Bjorkman 等[27]比较了使用乙酸酐在不同溶剂、温度、反应时间等条件下对 CTKs 类分子的乙基化结果，找到了一种简单、回收率高、副产物少的衍生化反应条件，使用 GC MS 对衍生化CTKs 的定量检测可以达到 pmol 级的检出限这种方法的缺点是：R3 为葡萄糖基的 CTKs 衍生化产物，在 GC MS 系统中不稳定;玉米素类和二氢玉米素类 CTKs 的衍生物在 EIMS 谱图中的分子离子峰很弱因此，该方法不适于这两类 CTKs 中新型分子的鉴定Birkemeyer 等 [28]使用 N 甲基 N ( 特丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)对 tZ、mT 以及吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)等植物激素同时进行衍生反应，从而实现用 GC MS 对多种植物激素的分离检测，其中对 tZ 的检出限达到0.9 pmol作者采用这种方法对 300 mg 植物根部样品以及秧苗样品中的植物激素进行了系统分析。
2.3 高效液相色谱法 (HPLC)7对 CTKs 进行定量分析的前提是各种 CTKs 的基线分离，液相色谱由于其强大的分离能力而在 CTKs 的检测中被广泛应用HPLC 方法的引入使 CTKs 的检测水平有了巨大的突破，由于不同的CTKs 显示出不同的极性，同时还具有稳定的紫外吸收，利用HPLC UV 法对 CTKs 进行定量分析是最先报道的方法使用最多的液相色谱 质谱联用法(LC MS) 兼有 LC 的分离能力和 MS 的高灵敏度(尤其是 MS/MS 系统)和高特异性[30 ～ 33], 同时 MS 信号还提供了被分析物的结构信息，为寻找新型 CTKs 提供了有力的手段最初尝试对 CTKs 进行分离的 HPLC 方法受到了柱填料的限制，后来非极性固相微粒材料的应用使得 HPLC 成为了最有效的CTKs 分离方法 1975 年，Carnes 等[34] 成功对 iP， Z 及其核苷衍生物进行了分离，分离速度达到了传统 LC 的 30 倍Stahly 等[35]利用 HPLC 对桃、梨和苹果样品中的玉米素及其核苷进行了分离检测如上所述，多种植物激素都具有紫外吸收，故可使用HPLC UV 法进行同时的分离和测定。
Ma 等[36] 以 C18 反相柱为固定相，使用甲酸 三乙胺缓冲溶液和甲醇溶液梯度洗脱，对经过固相萃取(SPE)纯化富集的椰汁样品中的玉米素和 6 苄基腺嘌呤(BAP)两种 CTKs 和 IAA、ABA 、赤霉酸(GA)4 类植物激素及其它 2种化合物进行分离，用光电二极管阵列检测器(DAD)进行检测流8出峰的归属通过 HPLC ESI MS/MS 进行确认在 10 μL 的进样条件下对玉米素和 BAP 的定量限(LOQ)分别达到 3.47 和 3.82 μmol/L目前，电喷雾离子化(ESI)在 CTKs 的 MS 检测中使用最为广泛[37～43]，Prinsen 等[37]首次利用 LC ESI MS/MS 的方法检测了 CTKs，建立了对 16 种不同 CTKs 的检测方法，检出限为 1 pmol他们还使用柱上浓缩的方法，在大体积进样的 Micro LC 和Capillary LC 与 MS/MS 联用上取得了更低的检出限 (在 Micro LC上为 5 fmol，在 Capillary LC 上为 0.1 fmol)[38]Nov k 等[40]报道了用 ESI 单四极杆质谱定量检测植物样品中所有异戊二烯型 CTKs 的高灵敏度方法。
方法中实现了 20 种非衍生的天然 CTKs 的基线分离通过柱后分流，将反相色谱柱的流出液同时引入 DAD 检测器和 MS 检测器通过对最终流量，去溶剂化温度、去溶剂化气体和电压等离子化参数的优化，确定了 ESI的最佳条件所测 CTKs 都主要以分子离子峰[M+H]+的形式被检测，检测线性范围为 0.025(0.075)～100 pmol，可以满足常规检测需要在实际样品的测定中，样品提取液通过两次不同的离子交换色谱纯化，然后再通过一种基于 CTKs 单克隆抗体的亲和免疫纯化LC MS 对样品中 CTKs 含量的测定结果还通过 LC 分离后的 ELISA方法进行了确证研究结果表明，该方法可以满足在生物样品中异9戊二烯型和异戊二烯衍生型 CTKs 的检测要求，但由于缺乏同位素标记内标，对于实际样品中芳香型 CTKs 的检测还需要进一步发展快原子轰击(FAB)离子源在 CTKs 检测方面的应用也有报道Astot 等[44]使用 capLC/frit FAB MS 检测了经过柱前丙酰化衍生的 CTKs，建立了选择离子监测模式(SIM)的定量方法Tarkowska等[39]和 Dole al 等[45]采用这种方法分别发现了两种新型的CTKs。
柱前衍生法在 LC 分离。