SPA的纯化、表达与鉴定中文摘要：该实验用大肠杆菌做表达载体，然后用IPTG诱导大肠杆菌表达SPA,破 碎大肠杆菌提取SPA后用镰柱纯化，再运用SDS-PAGEs双向免疫扩散法、 wester n blottin g等方法对表达的蛋片质进行鉴定，其中制备免疫血清（抗 SPA免疫血清）选取的动物为雄性健康成年的家兔中文关键词：SPA、SDS-PAGE、western blot.ting＞双向免疫扩散前旨1. SPA的背景SPA B|J （Staphylococcal protei n A, SPA）葡萄球菌A蛋白，是匍萄球菌细胞壁的一种 表面蛋宜（单链多肽），能与人及某些哺乳类动物的IgG分了的Fc段发生非特异性结 合,SPA与IgG结合后的复合物具有抗吞噬，促细胞分裂，致超敏反应和损伤血小板等活 性.（一） SPA的主要存在部位SPA存在于大多数（90%）金黄色匍萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中；并且主要 存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中前者是致病的，示者是非致病的，但 在体内研究中询未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系不同菌株间的SPA含量有 明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。
抗二甲氧 基苯育霉索突变株（methicillin-resistant strain）能产生分泌SPA,它较Z细胞壁所含 的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少二） SPA的相对分了质量及等电点SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其相对分了质量因提取方法不同而异, 用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁示超速离心或用加热抽提法，所测相对分了质量为12000〜 15000o用沉淀平衡分析和在6mol/L鸟嚓吟盐酸中凝胶过滤，测出相对分了质量为42000 SPA为单链多肽，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含 色氨酸和半胱氨酸其竣基末端是赖氮酸,氮基末端结构尚未肯定SPA黏度高于球蛋白, 等电点（pi）为5. 1,其天然结构十分稳定,在应用6 mol / L鸟嚓吟盐酸变性剂的条件下, 尚能保存某些三级结构，如将变性剂除去，则能白然矫正而恢复原有结构三） SPA的免疫学特性SPA具有和人及许多动物（如豚鼠、猪、小鼠、猴等）I或结合的能力SPA结合部位是 Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性SPA具有的结合力是双价的，每个SPA 分了可以同时结合2个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物［如荧光素、 酶（HRP、AKP和GO等）、胶体金和铁蛋白等］相结合。
还有一个饶有兴趣的事实是，与SPA 结合后IgG可用4m"/L鸟喋吟盐酸等使Z解离利用这一生物化学特性，可以将SPA交联 在匍聚糖凝胶上，对抗原或抗体蛋白质进行纯化SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择 性,如SPA与人IgG亚型IgGl、IgGz和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3；只结合IgII2, 而不结合IgHE SPA与人及大部分哺乳动物血清中的IgG结合，能反应的动物包括豚鼠、小 鼠（纯种）、狗、猪、猴和经免疫的家兔等其结合部位为免疫球蛋白的CH2和53的交界 处另外，它还能与少数血清中的IgM结合SPA还能激活和固定补体，激活B淋巴细胞， 促使其成熟并分泌产生备类免疫球蛋白四） SPA的生物学特性1. 免疫原性与过敏原性：SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig, 乂能与其相 应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应SPA-TgG注射家兔皮下可引起Arthu s样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应SPA体外试验，能刺激豚鼠离体冋肠收缩2. 抗吞噬作用：由于IgG的Fc段结合点既是IgG调理活性结合点，又是SPA反应 点因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SP A阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。
3. 固定补体：SPA-IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗 等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径4. 促有丝分裂因了： SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T 细胞辅助，可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与5. 去封闭作用：固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而 降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用五) SPA的应用1 •应用于免疫球蛋白的制备和分析：SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的 试剂由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球 蛋白制剂，结合麻的PSA—IgG可再用解离剂如4mol/L尿索、4mol/L,硫孰酸盐或6mol/L 的鸟II票吟盐酸盐使之解离，多用SPA—Sepharose层析柱分离TgG或其亚型及断片如FcxFab 等2•丿应用于免疫细胞化学：由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥 抗体或标记抗体由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记 抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到 广泛的应用。
除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色 淡等优点据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半 SPA分子量小(13000〜42000),易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000, PAP 复合物为430000,均较SPA分了量大3. 应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体, 结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型4. 可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂Hallgsen用 同位素标记SPA测定血IgG的凝集物，发现85%全身性红斑狼疮和42礫风湿病人血清中凝 集物增高SPA用于细胞膜抗原、表血IgG和Fc受体的研究战大特点是能研究活细菌Ghetie(1976)用SPA致敏绵羊红血•球，与经IgG处理的细胞形成玫塊花环，来鉴定带Fc受体的 细胞，反Z,如用SPA抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的TgG应用SPA与胶体 金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位特别是蛋H A—胶体金技术 (Protein A— old technique, PGA 技术)自 Pomano 和 Romano (1977)首次报告用于标记 细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已 得到愈来愈广泛的应用，是一种校为理想的免疫电镜技术。
实验原理1・SPA的原核表达大肠杆菌表达的基木概念：一个完敕的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株, 如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等 选择表达系统通常要根据实验H的来考虑，比如表达量高低，目标蛋H的活性，表达产物的 纯化方法等等主要归结在表达载体的选择上表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合bg （如 果有的话），复制了，筛选标记/报告基因等通常，载体很贵，我们可以通过实验室Z间交 换得到免费的载体但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员Z手的载体是否保持原 来的遗传背景？ MCS是否还是原来那个MCS?是我们要特别注意的E. coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖廿酶、透酶和 乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因II基因编码 -种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态在启动序列P 上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点由P序列、0序列和CAP结 合位点共同构成lac操纵了的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产 物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵了（元）处于阻遏状态此时，I序列在PI 启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与0序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转 录起动当有乳糖存在时，be操纵子（元）即可被诱导在这个操纵子（元）体系中，真 正的诱导剂并非乳糖木身乳糖进入细胞，经b —半乳糖苛酶催化，转变为半乳糖后者作 为一种诱导剂分了结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化 导致阻遏蛋白与0序列解离、发生转录 异丙基硫代半乳糖廿UPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被 实验室广泛应用T,噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一•体系中的元件为基础构建的表 达系统称为4表达系统T?噬菌体基因编码的T7 RXA聚合酶选择性的激活T?噬菌体启动子 的转录它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RXA聚合酶快5倍 左右并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列在细胞中存在T7 RNA 聚合酶和T?噬菌体启动了的情形下，大肠杆菌宿主木身基因的转录竞争不过T,噬菌体转录 体系，报终受T?噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平A噬菌体启动子的转录完全依赖于T? RNA聚合酶，因此T? RNA聚合酶的转录调控模式就决 定了表达系统的调控方式。
噬菌体DE3是X噬菌体的衍生株，一段含有lad , lacUV5启 动了和T? RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如 BL21（DE3）. HMS174（DE3）等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于 Lac表达系统2. SDS-PAGE检测表达的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N,N” -甲叉双丙烯酰胺 （Bis），在催化剂（过硫酸銭或核黄素，前者为化学聚合，品者为光聚合）和加速剂TEMED （N, N, N\ N\ —四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶改变单体 的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶（孔径大小可以通过改变单体Acr 的浓度或单体与交联剂的比例而控制）0蛋白质分了是两性电解质分了，在真流电场内可以移动，PAGE过程中具有三种物理效 应：（1） 凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分了通过凝胶孔洞时的阻力 大，移动慢；（2） 不连续系统对样品的浓缩效应凝胶层的不连续：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋片质颗粒在 大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。
因而在两层凝胶交界处，由于 凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带缓冲液离了成分及pH的不连续: 在两层凝胶中均有三瓮甲基氨基甲烷（Tris）及IICIo Tris的作川是维持溶液的电中性及 pll值，是缓冲配对离了，IICI在任何pll值溶液中均易解离出氯离了，它在电场中迁移率大, 走在最前面，故称为快离了或前导离了电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）在pH8. 3的缓冲液 中其解离度很小，仅为0. 1% —1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子血清中，大多数蛋H质等电点在5.0左右，在pII8. 3或6. 7时均带负电荷，在电场中移向正 极，其有效迁移率介于快慢离了之间，于是蛋H质就在快慢离了间形成的界面出，被浓缩成 极窄的区带三者的有效迁移率为maa a> m蛋白a蛋白〉m甘a甘（m为迁移率,a为解离度）， 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离了及甘 氨酸离子沿着离子界血继续前进蛋白质分子由于分子量大,被留在后面,然后分成多个区 带，因此分离胶Z间pll的不连续性可控制其迁移率。