石蜡切片（Ⅰ、Ⅱ）,王立英,吉林大学珠海学院化学与药学系,【实验目的】,掌握石蜡切片的制作过程 掌握HE染色的基本原理和染色方法,【实验原理】,用石蜡渗透固化组织 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细胞核着色 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞中的嗜酸性成分着色，如蛋白质材料与器材】,材料：鼠肝 试剂：卡诺固定液，苏木精染液，1%盐酸乙醇液，各级乙醇，二甲苯，石蜡 器材：切片机，恒温箱，解剖刀，镊子，酒精灯，包埋纸盒，染色缸，水盘，小台木等实验过程】 石蜡切片Ⅰ,取材 固定 洗涤 脱水 透明 透蜡 包埋 切片 贴片,石蜡切片Ⅱ,脱蜡复水 染色 水洗 分化 漂洗 脱水Ⅰ 复染 脱水Ⅱ 透明 封藏,1、取材：剪取组织5mm×5mm×2mm动作要迅速 2、固定：生理盐水洗后，立即投入卡诺固定液固定30~50min 3、洗涤：常用水洗涤或50%～70%乙醇冲洗 4、脱水：70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min※注意：更换高一级的脱水剂时要用吸水纸将器皿内的余液吸尽5、透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯30min（或至透明为止），须换一次二甲苯。
6、透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20～30min 7、包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块8、切片,将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上 摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口 刀片与石蜡切片约成15度左右 厚度一般为4～10微米 切成的蜡带到20～30cm长时，用另毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上9、贴片,①、取一载玻片，滴一滴粘片剂用手指涂抹， ②、滴1～2滴的蒸馏水载玻片上 ③、用小镊子夹取蜡带，放在水面上，蜡片光亮面贴于玻片上，稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签 ④、酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展 ⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染10、脱蜡复水,石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5～10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3～5min，再放入蒸馏水中3min 染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。
一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多11、染色,切片放入苏木精中染色约10～30min染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色12、水洗,用自来水流水冲洗约15min冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止13、分化,就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差如果染色适中，可取消此步骤14、漂洗,切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准然后放入蒸馏水中漂洗一次15、脱水Ⅰ,切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3～5min。
16、复染,用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色17、脱水Ⅱ,放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3～5min最后用吸水纸吸干多余的乙醇18、透明,切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3～5min二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检19、封藏：中性树胶封存,切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本注意事项】,取材动作要迅速；固定液必须充足，一般为材料块的20～30倍，有些水分多的材料，中间应更换1～2次新液； 高浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则会使组织变脆，如需过夜，应停留在70%酒精中；脱水必须彻底； 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入；在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明； 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；操作要迅速，在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
石蜡切片机,,,,,,,,,,,切片厚薄微调器,切片厚薄粗调器,离合器,滑动刀座,旋转手轮,手轮停止旋转手柄,切片接收托盘,刀片固定旋钮,,,,蜡块竖向调整旋钮,蜡块固定器锁紧扳手,蜡块钳,横向调整旋钮,,切片刀倾斜角度调整扳手,,,应先夹紧蜡块再装刀 在每次操作切片机和标本或是工作间隙一定要先锁定手轮 手轮转动要均匀，并且转动速度一定要与标本的硬度相适应，在切较硬的标本时速度应慢些。