实验二--总糖与还原糖的测定(DNS) 实验二总糖和还原糖的测定──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量三、试剂和器材1、试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取5.0g DNS溶于200ml 2mol/L NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入到酒石酸甲钠的热溶液中（192g就是酸甲钠溶于500ml水中），再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，摇匀溶解后，冷却定容至1000ml，暗处保存备用葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中0.1% 酚酞指示剂：2、材料藕粉，玉米淀粉3、器材WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，15mm×180mm试管四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖含量OD540/ml /ml /mg0 1 00.210.80.42 0.4 0.6 0.83 0.6 0.4 1.24 0.8 0.2 1.65 1 0 2在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线2、样品中还原糖的提取准确称取0.5g藕粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
3、样品总糖的水解及提取准确称取0.5g玉米淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全如已水解完全，则不呈现蓝色水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定4、样品中含糖量的测定取7支15mm×180mm试管，分别按下表加入试剂：加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量5、结果处理按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：%1001000%1001000C Vm C Vm ??????还原糖（以葡萄糖计）＝总糖（以葡萄糖计）＝式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml ；V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml ；m──样品重量，g ；1000──mg 换算成g 的系数五、注意事项标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色思考题1. 比色时为什么要设计空白管？2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？ -全文完-。