第三章第三章 细胞工程基本技术细胞工程基本技术 一、细胞工程实验室的设置一、细胞工程实验室的设置 1 动物细胞工程实验室的设置动物细胞工程实验室的设置 无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间 培养观察室培养观察室 制备室制备室 储藏室储藏室 清洗与灭菌室清洗与灭菌室 l2 植物细胞工程实验室的设置l 除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等 二、常用仪器与设备二、常用仪器与设备超净工作台超净工作台倒置显微镜和相差显微镜倒置显微镜和相差显微镜干燥箱干燥箱水纯化装置水纯化装置冰箱（冰箱（4 ℃、、-20℃、、 -70℃））压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器 l细胞记数板和电子细胞记细胞记数板和电子细胞记数仪数仪l过滤除菌装置过滤除菌装置l离心机离心机l移液管、吸管移液管、吸管l离心管离心管l移液器移液器l天平天平 动物细胞工程实验室基本设备仪器动物细胞工程实验室基本设备仪器 1 培养箱培养箱二氧化碳培养箱，提供恒定二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（（5%））以稳定以稳定pH值，温度：哺乳类值，温度：哺乳类35℃-37℃，，鸟类鸟类38.5℃，气相：，气相：O2、、CO2、、pH7.2-7.42 显微操作仪仪 3 细胞融合仪 4 细胞冷冻储存器细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196℃）5 培养用器皿培养用器皿 各种培养瓶、 培养皿、多孔培养板（6、24、96）6 手术器械等手术器械等 植物细胞工程实验室基本设备仪器植物细胞工程实验室基本设备仪器光照培养箱光照培养箱人工气候室人工气候室摇床摇床培养瓶培养瓶 三、实验室的生物安全三、实验室的生物安全 根据密封程度的不同根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级将生物安全分为四个等级,即即: P1、、P2、、P3、、P4 （（protect）） 一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：是： 1、限制随便出入实验室；、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；和存放食品；5、操作时着专门实验服；、操作时着专门实验服；6、处理细、处理细胞前后要洗手；胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。
操作时在超净工作台 四、培养用品的清洗四、培养用品的清洗l在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节洗和灭菌是极为重要的环节l 清洗的目的是清除杂质和微生物清洗的目的是清除杂质和微生物,使器使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）化学成分） 1、玻璃用品的清洗、玻璃用品的清洗 在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油洗清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质某些化学物质仅百迹，而且不能残留任何物质某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用因此，万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行 一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
和冲洗四个步骤 ①① 浸泡浸泡 初初次次使使用用和和培培养养用用后后的的玻玻璃璃器器皿皿都都需需先先用用清清水水浸浸泡泡，，以以使使附附着着物物软软化化或或被被溶溶掉掉培培养养后后的的玻玻璃璃器器皿皿多多附附有有大大量量蛋蛋白白质质，，用用完完后后应应立立即即初初步步刷刷洗洗，，浸浸泡泡在在蒸蒸馏馏水水中中，，注注意意让让水水完完全全进进入入瓶瓶皿皿中中，，不不要要留留有有气气泡泡使使用用新新的的器器皿皿应应先先用用自自来来水水简简单单刷刷洗洗，，然然后后用用稀稀盐盐酸酸(5％％)浸浸泡泡过过夜夜或或煮煮沸沸30分分钟钟，，中和其中的碱性物质后再清洗中和其中的碱性物质后再清洗②② 刷洗刷洗 浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗热）刷洗 ③③ 浸酸浸酸 刷刷洗洗不不掉掉的的极极微微量量杂杂质质经经过过清清洗洗液液浸浸泡泡的的强强氧氧化化作作用用可可被被除除掉掉清清洗洗液液对对玻玻璃璃器器皿皿无无腐腐蚀蚀作作用用，，去去污污十十分分有有效效，，是是清清洗洗过过程程中中关关键键环环节节清清洗洗液液是是由由重重铬铬酸酸钾钾、、浓浓硫硫酸酸和和水水按按一一定定比比例例配配制制而而成成。
浸浸泡泡时时器器皿皿要要充充满满洗洗液液，，不不留留气气泡泡浸浸泡泡时时间间不不应应少少于于6小小时时，，一一般应浸泡过夜般应浸泡过夜 l清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种：三种：l强液：重铬酸钾强液：重铬酸钾63g，，浓硫酸浓硫酸1000ml，，蒸馏水蒸馏水200mll次强液：重铬酸钾次强液：重铬酸钾120g，，浓硫酸浓硫酸200ml，，蒸馏水蒸馏水1000mll弱液：重铬酸钾弱液：重铬酸钾l00g，，浓硫酸浓硫酸l00ml，，蒸馏水蒸馏水1000mll l 配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸l 新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置应废弃而重新配置l l 也可以使用也可以使用10％～％～40％的硝酸溶液％的硝酸溶液 ④④ 冲洗冲洗 玻玻璃璃器器皿皿浸浸酸酸后后必必须须用用流流水水充充分分冲冲洗洗，，每每个个器器皿皿用用流流水水灌灌满满、、倒倒掉掉，，必必须须重重复复十十次次以以上上，，不不留留任任何何残残迹迹。
最最后后用用蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗2~3次次，，用用双蒸水漂洗双蒸水漂洗1次，烤干备用次，烤干备用 玻玻璃璃滤滤器器原原则则上上与与玻玻璃璃器器皿皿清清洗洗相相同同无无论论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法 2、橡塞清洗、橡塞清洗 新新购购置置的的瓶瓶塞塞带带有有大大量量滑滑石石粉粉及及杂杂质质，，应应先先用用自自来来水水冲冲洗洗胶胶塞塞类类橡橡胶胶用用品品，，每每次次用用后后先先用用蒸蒸馏馏水水浸浸泡泡，，然然后后用用2％％NaOH煮煮沸沸10-20 min，，用用自自来来水水冲冲洗洗干干净净，，再再用用1％％稀稀盐盐酸酸浸浸泡泡30min，，用用自自来来水水冲冲洗洗、、蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗2-3次次，，最最后后双双蒸蒸或或三三蒸蒸水水漂漂洗洗1次次，，晾干后备用晾干后备用 l3、塑料器皿的清洗、塑料器皿的清洗l 细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等这些产品主要是进口的一次养皿及培养瓶等这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。
l 如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用附着物，用2％％NaOH浸泡过夜，流水冲净后再浸泡过夜，流水冲净后再用用5％盐酸浸泡％盐酸浸泡30min，，自来水冲洗、蒸馏水漂自来水冲洗、蒸馏水漂洗洗2~3次，最后三蒸水漂洗次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用次，晾干备用 五、消毒灭菌五、消毒灭菌l防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染l 消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法总的来说有物理方法和化学方法两大类l 物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物l 化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物 （一）物理灭菌法（一）物理灭菌法1、紫外线消毒、紫外线消毒 常用来消毒空气，操作表面和一些不能用常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其它方法消毒的物品其它方法消毒的物品(如塑料培养皿等如塑料培养皿等)一般距紫外灯距紫外灯2.5米范围内直接照射米范围内直接照射20分钟即可分钟即可 ２、电离辐射消毒２、电离辐射消毒 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。
用品 l３、湿热灭菌３、湿热灭菌l 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法布类、胶塞、金属器械、最有效的一种方法布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌l 各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制品要求一般培养用液、橡胶制品要求10磅磅(114℃)，，10～～20分钟或分钟或8磅磅(112℃)30分钟布类、玻分钟布类、玻璃制品、金属器械等为璃制品、金属器械等为15磅磅(12l℃)20分钟分钟 l４、干热灭菌４、干热灭菌l 主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌用 主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌用电热鼓风干燥箱加温到电热鼓风干燥箱加温到160℃，保持，保持1小小时或更长时间，可达到消毒目的金属时或更长时间，可达到消毒目的金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法l 灼烧也属于干热消毒灭菌方法灼烧也属于干热消毒灭菌方法 ５、滤过除菌５、滤过除菌 大大多多数数培培养养用用液液，，如如人人工工合合成成培培养养液液、、血血清清、、酶酶溶溶液液等等，，在在高高温温下下会会变变性性，，失失去去功功能能，，必必须须采采用用滤滤过法除菌。
过法除菌 玻玻璃璃滤滤器器适适用用于于各各种种培培养养液液的的滤滤过过除除菌菌玻玻璃璃滤滤器器根根据据滤滤板板的的孔孔径径分分为为G1一一G6几几种种规规格格，，一一般般采采用用G6型型(孔径在孔径在1.5μm以下以下)，可达到除菌目的可达到除菌目的 微微孔孔滤滤膜膜滤滤器器，，应应选选用用孔孔径径为为0.22μm的的滤滤膜膜过过滤滤除菌 各各种种滤滤器器必必须须先先经经高高压压蒸蒸气气消消毒毒、、烤烤干干后后方方可可使使用 （二）化学消毒法（二）化学消毒法１、消毒剂１、消毒剂 细细胞胞培培养养室室的的工工作作面面、、家家具具、、墙墙壁壁、、地地面面和和空空气气等等可可用用消消毒毒剂剂进进行行灭灭菌菌处处理理如如：：75％％酒酒精精常常用用于于皮皮肤肤和和瓶瓶皿皿开开口口部部位位的的消消毒毒；；0.1％％新新洁洁尔尔灭灭是是目目前前最最常常用用的的消消毒毒剂剂，，可可以以对对器器械械、、皮皮肤肤、、操操作作面面进进行行擦擦拭拭和和浸浸泡泡消消毒毒；；乳乳酸酸可可用用于于空空气气消消毒毒：：来来苏苏儿儿可可用用于于地地面面消消毒毒；；过过氧氧乙乙酸酸消消毒毒能能力力很很强强，，在在0.5%的的浓浓度度下下，，10min就就可可将将芽芽孢孢菌菌杀杀死死。
甲甲醛醛是是一一种种光光谱谱灭灭菌菌剂剂，，其其水水溶溶液液和和气气体体对对各各种种细细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用 l２、抗生素２、抗生素l 抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同 抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防l 最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等常规培养用液抗生素浓度为：青霉素素等常规培养用液抗生素浓度为：青霉素100单位／单位／ml、、链霉素链霉素100单位／单位／m1、、庆大霉庆大霉素素50μg／／m1或或l00μg／／m1 六、污染检测与控制六、污染检测与控制 污污染染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能 在众多的污染源中，微生物是最突出最重要最常见的污染 (一一)微生物污染的途径微生物污染的途径 空气、器材、操作、血清和组织样本等 （二）污染对培养细胞的影响及检测（二）污染对培养细胞的影响及检测l1、细菌的污染检测与控制、细菌的污染检测与控制l 当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。
显微镜下观察可见培养液产生大量酸性物质显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡l采用普通肉汤培养基也可以检测到污染采用普通肉汤培养基也可以检测到污染l用青霉素、链霉素可预防细菌的污染用青霉素、链霉素可预防细菌的污染 l2、真菌的污染检测与控制、真菌的污染检测与控制l常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等在培养液表菌、白念珠菌、酵母菌等在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物显微镜面会出现白色或浅黄色漂浮物显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝管状及树枝状菌丝l可用抗真菌剂防止真菌污染可用抗真菌剂防止真菌污染l l3、支原体的污染检测与控制、支原体的污染检测与控制 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。
目前尚或少的影响到细胞的众多机能目前尚无有效的防范措施可通过支原体培养、无有效的防范措施可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测及电镜观察等方法进行检测l支原体的去除可采用：支原体的去除可采用：4141 ° °C C l4 4、病毒的污染检测与控制、病毒的污染检测与控制l 病毒的污染主要是通过病毒的污染主要是通过DNADNA的整合，的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性的生长或干预实验结果的准确性l 对病毒的检测主要有直接观察、动对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及物接种检查、电镜观察、免疫学及PCRPCR法 l5、细胞交叉污染及检测、细胞交叉污染及检测l 在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测l 有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备l （三）污染的预防 1、培养操作前的准备(超净工作台的严格护理) 2、培养操作时的注意事项 3、其他注意事项 七、无菌操作技术七、无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要求）l在细胞培养中防止污染是决定培养成功在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。
由于体外培养细胞或失败的首要条件由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染努力做到最大限度的无菌，防止污染为达到这一要求，所有工作要进行得有为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠条不紊和安全可靠 （一）培养前的准备（一）培养前的准备 要要充充分分做做好好培培养养前前的的实实验验用用品品准准备备工工作作，，根根据据研研究究内内容容的的要要求求进进行行物物品品清清点点包包装装，，注注明明标标签签后后灭菌、烤干备用在工作前移入超净工作台内灭菌、烤干备用在工作前移入超净工作台内二）培养室和超净工作台的消毒（二）培养室和超净工作台的消毒 工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌，用灯灭菌，用30W紫外线灯管直接照射紫外线灯管直接照射20——30分钟然后关闭紫外灯，打开风机然后关闭紫外灯，打开风机超净工作台要用超净工作台要用75％酒精擦拭％酒精擦拭培养用液和培养细胞不能放在紫外培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入线下直接照射，在操作时随手携入。
（三）洗手和着装（三）洗手和着装 原原则则上上与与外外科科手手术术洗洗手手相相同同：：先先用用肥肥皂皂刷刷洗洗手手和和前前臂臂，，再再用用流流水水冲冲洗洗，，然然后后用用0.2％％新新洁洁尔尔灭灭或或75％％洒精棉球擦洗穿无菌服，戴无菌帽和口罩洒精棉球擦洗穿无菌服，戴无菌帽和口罩四）无菌培养操作（四）无菌培养操作 在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（火焰火焰消毒）消毒） 注意金属器械不能在火焰上烧灼时间注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火烧过的用具要待冷却过长，以防退火烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤后才能挟取组织，以免造成组织损伤 l进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会l 不能用手触及器皿的无菌部分，如已接不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。
触，要更换或用火焰烧灼触及部 为为拿拿取取方方便便，，工工作作台台面面上上的的布布局局要要合合理理，，原原则则上上为为右右手手使使用用方方便便的的用用品品放放在在右右侧侧，，左手用品在左侧左手用品在左侧 培养液等不要过早开瓶，不要长时间直培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会立暴露开口，以免增加污染机会 吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会 八、显微技术l各种显微镜技术l同细胞生物学要掌握原理与应用 九、细胞观察与分析九、细胞观察与分析l细胞在培养过程中，要及时观察和了解细胞在培养过程中，要及时观察和了解生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各种状态的时间参数、细胞数量、分等各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置等指标，以及体外因素对这些指布位置等指标，以及体外因素对这些指标的调节机制这属于细胞动力学的研标的调节机制这属于细胞动力学的研究广义的细胞动力学还包括其它的细究广义的细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原理的研究。
胞运动及其原理的研究 （一）细胞技术与活力分析（一）细胞技术与活力分析l1、细胞计数法、细胞计数法l 用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整l l2、细胞生长曲线、细胞生长曲线l 生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细胞浓度之间关系的曲线以时间（横坐标）对细胞浓度（细胞数/ml为纵坐标）绘制，反映培养过程中细胞生长与死亡的动态变化 3、有丝分裂指数的测定、有丝分裂指数的测定 在一群细胞中，进入分裂期细胞所占该群细胞的百分率，即为有丝分裂指数它反映了细胞增殖的速度 分裂细胞数 分裂指数 = ×100% 细胞总数4、细胞贴壁率、细胞贴壁率 又又称接种存活率，贴壁附着生长的细胞状况直接反映细胞的生存能力 5、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测细胞周期 细胞周期各时相控制并按一定的时间顺序予以表达的，而细胞周期各时相的分析，特别是细胞周期及其各时相时长的测定对于研究细胞群体的生长行为，尤其是对于包括DNA复制、细胞分裂在内的细胞增殖调节控制的研究，无疑是一个很重要的前提。
基本步骤基本步骤l细胞培养细胞培养l消化细胞计数消化细胞计数l种植种植60 mm 培养皿（培养皿（70 X104 个细胞个细胞/皿）皿）l药物处理细胞药物处理细胞l收细胞（胰蛋白酶消化收细胞（胰蛋白酶消化----培养基终止）培养基终止）l2000转转/分分 离心离心 10minl去上清液去上清液PBS重悬，重复重悬，重复6的步骤的步骤l去上清加入去上清加入100 ul 1mg/mlPI 和和100ul 1mg/ml RNase A, 避光处理避光处理30minl流式细胞仪检测流式细胞仪检测 6、、MTT比色法测定细胞活力比色法测定细胞活力 活细胞表现出线粒体脱氢酶活性，可将染料MTT还原为难溶的紫色结晶物沉积在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平而死细胞则无此酶活性 lMTT检测细胞存活率检测细胞存活率l基本步骤基本步骤l细胞培养细胞培养l消化细胞计数消化细胞计数l种植种植96孔板（孔板（1~10X 103 个细胞个细胞/孔）孔）l药物处理细胞，结束药物处理细胞，结束4小时前每孔加入小时前每孔加入20 ul 5 mg/ ml MTTl弃上清，每孔加弃上清，每孔加100 ul DMSOl560 nm 检测检测lViability (%) = OD560, TV/OD560, control × 100 l7、成集落实验（、成集落实验（Colong-forming test））l 在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。
l 平均集落数l 集落形成率 = ×100%l 接种的单个细胞数 （二）细胞固定与染色观察（二）细胞固定与染色观察l1、细胞固定、细胞固定l2、细胞染色、细胞染色 H.E（苏木精（苏木精-伊红）：样品制备、染细胞伊红）：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封片核、染细胞质、脱水、透明和封片 Giemsa染色法：细胞核或染色体染成紫红染色法：细胞核或染色体染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色色或蓝紫色，细胞质染成粉红色 Feulgen染色法：染色法： 考马斯亮蓝染色法：细胞骨架考马斯亮蓝染色法：细胞骨架 l 免疫荧光染色免疫荧光染色l 免疫过氧化物酶染色法免疫过氧化物酶染色法 3、细胞培养中常用的染色方法、细胞培养中常用的染色方法l活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活动不而对活细胞的生理活动不产生任何明显的影响。
产生任何明显的影响l 用于活体染色的染料称为活体染料或活体用于活体染色的染料称为活体染料或活体染色剂，分为碱性和酸性两类：染色剂，分为碱性和酸性两类：l 碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳斯碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色绿、甲基紫等，常用于体外活体染色l 酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用于酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用于体内活体染色，体外活细胞难以着色体内活体染色，体外活细胞难以着色 l 活体染色方法活体染色方法l1）台盼蓝染色）台盼蓝染色l 活细胞不着色，死细胞染上兰色活细胞不着色，死细胞染上兰色l2）吖啶橙荧光染色法）吖啶橙荧光染色法l 直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞 l 吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与DNA和和RNA都能结合的荧光都能结合的荧光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细胞，染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细胞，其核呈亮绿色，核仁、其核呈亮绿色，核仁、RNA呈桔红色，胞质呈呈桔红色，胞质呈淡红褐色而原来是已经死亡的细胞，核呈暗淡红褐色。
而原来是已经死亡的细胞，核呈暗绿色，胞质呈亮铜色绿色，胞质呈亮铜色 l 染色排除检测法染色排除检测法 l 以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别 死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而不能排出，因此而着色而活细胞能及时排出进入不能排出，因此而着色而活细胞能及时排出进入细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色l 这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、苯这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、苯胺黑、赤藓红胺黑、赤藓红B、伊红、伊红Y等l1、台盼蓝排除检测法、台盼蓝排除检测法 l2 、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法l EB和和PI均为荧光染料，可特异与均为荧光染料，可特异与DNA结合发橙红色荧光的为死细胞橙红色荧光的为死细胞 （四）凋亡细胞的观察l细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，是在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程，亦称为程序化细胞死 亡(programmed cell death，PCD) 形态学检测形态学检测l光学显微镜观察光学显微镜观察 样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、HE染色后，染色后，即可放在油镜下观察。
该方法简便，缺点是只即可放在油镜下观察该方法简便，缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，而且为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，而且某些类型的细胞坏死某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死如凝固性坏死)与细胞凋与细胞凋亡形态相似，两者不易区分因此，该方法只亡形态相似，两者不易区分因此，该方法只能作为细胞凋亡初步推测的基础，不能作为诊能作为细胞凋亡初步推测的基础，不能作为诊断的手段断的手段 荧光显微镜观察l根据细胞膜完整的活细胞对阳离子染料有拒染能力，而坏死细胞可被上述染料标记的原理，用荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等染色，在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测．组织脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察荧光显微镜检查法方便易行，现已成为细胞凋亡检查的常用手段 透射电子显微镜观察l凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小，细胞质浓缩，内质网、线粒体增多，细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。
但该法只能定性，不能定量，而且观察到凋亡小体的几率也不高，在体内试验时，凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除，而不易观察到；此外，用电子显微镜检测细胞凋亡，样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵 共聚焦激光扫描显微镜检测l共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型仪器，是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使紫外光和可见光激发荧光探针，从而得到清晰的细胞内部结构该方法能用于细胞的形态学分析，而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位 l上述形态学检测方法最大的局限性是只能定性，不能有效定量，而且判定时难免存在主观性，故常作为其他检测方法的基础 凋亡细胞膜结构的分析与检测 l染料排斥法 除了电子显微镜能反映细胞膜的完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等坏死细胞的膜发生破损，易被染料着染，而凋亡细胞的膜完整，不被着染，从而可以判断细胞凋亡与l坏死但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Ap细胞是否发生凋亡 流式细胞仪观察法l流式细胞仪观察是判断细胞质膜的不对称性在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)位于细胞膜的内侧；而在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。
因此，PS基团位置的改变，可作为凋亡细胞的一种标志膜联蛋白中的Annexin—V，即锚定蛋白，是一种Ca依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高亲和力将Annexin—V进行荧光素(FITC、PE)标记，以标记的Annexin—V处理细胞悬液，利用流式细胞仪(或荧光显微镜)即可检测细胞凋亡的发生若将Annexin—V和荧光素PI匹配使用，可以将凋亡细胞和坏死细胞区分开来：Annexin—V为阳性，PI为阴性的细胞即为凋亡细胞；双染色细胞或是坏死细胞，或是凋亡晚期细胞(归因于次级坏死) DNA片段化检测 DNA 电泳图谱法 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂，形成180～ 200 bp长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段凋亡细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱，而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状 ELlSA 法分析组蛋白l细胞发生凋亡时，Ca 、Mg 依赖性内源性核酸内切酶被激活，在核小体连接区切开双链DNA，产生带有单个或寡聚核小体的DNA片段而核小体DNA 与中心组蛋白H z A、H。
B、Hs和H 紧密结合，又可以防止核酸内切酶的切割作用，故产生的DNA 片段是180～200bp的整数倍，在凋亡细胞的胞浆中出现核小体或寡聚核小体⋯]该法是利用“夹心定量酶标免疫测定法”的原理，用抗组蛋白一生物素和抗DNA一过氧化物酶(POD)分别结合到核小体的组蛋白和DNA l成分上，洗涤除去未结合的抗体后，加入成分上，洗涤除去未结合的抗体后，加入POD底物产生颜色反应，通过酶标测定仪分析，即底物产生颜色反应，通过酶标测定仪分析，即可定量反映细胞凋亡的水平该方法的优点是：可定量反映细胞凋亡的水平该方法的优点是：灵敏度高，操作快捷，无放射性同位素污染，灵敏度高，操作快捷，无放射性同位素污染，可定量测定细胞凋亡，无需预先标记细胞，所可定量测定细胞凋亡，无需预先标记细胞，所用抗体不具有种属特异性，用抗体不具有种属特异性，POD标记的抗标记的抗DNA抗体可与单链和双链的抗体可与单链和双链的DNA起反应抗体夹心起反应抗体夹心酶联免疫分析法可以测定核小体单体和寡聚核酶联免疫分析法可以测定核小体单体和寡聚核小体，因而可以用于许多不同的培养细胞株或小体，因而可以用于许多不同的培养细胞株或动物组织细胞的凋亡检测动物组织细胞的凋亡检测 ]。
DNA 末端标记法l1993年Wijsman等提出了DNA 片段末端标记法，1994年Fehsel等提出了原位缺口转移检测细胞凋亡的方法这些方法的建立特别是由DNA片段末端标记技术发展而成的TUNEL法[termina deoxy nucleotibyl trans—ferase(TdT)一mediated dUTP—biotin nick end label—ling，TUNEL labeling 的试剂盒化，使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用 举例形态学检测基本步骤l细胞培养l消化细胞计数l种植24孔板（1~5X 104 个细胞/孔）l药物处理细胞l用数码照相架拍摄形态照片l吸走培养基，PBS洗涤一次，95%乙醇固定20minl吸走乙醇每孔加200ul 丫啶橙避光10min l激光共聚显微镜观测 PS（磷脂酰丝氨酸）外翻检测基本步骤l细胞培养l消化细胞计数l种植60 mm 培养皿（70 X104 个细胞/皿）l药物处理细胞l收细胞（胰蛋白酶消化----培养基终止）l调整细胞密度为1X106/ mll取500ul 加入1.25 ul Annexin V-FITC 室温避光处理15minl400g 离心 10minl去上清，500ul PBS重悬, 加1.25 ul 10mg/mlPIl流式细胞仪或激光共聚焦检测检测 TreatmentType of cell death ( % of total cells)early apoptosis late apoptosis necrosisControl 3.33± 0.50 2.07± 0.55 2.14± 0.15TV(15 ) µM 24h 23.22 ±1.39 9.09± 0.82 3.56± 0.5148h 24.91±0.98 19.28±1.04 3.64±0.4172h 29.42±4.58 32.96 ±0.51 1.42±0.5896h 31.11±3.28 50.98 ±1.90 8.83±1.27 十、细胞培养物的保存和复苏十、细胞培养物的保存和复苏（缓冻速溶）（缓冻速溶）保存：低温冷冻保存法保存：低温冷冻保存法 冷冻保护液：含10%血清的培养液中加10%的甘油或7.5%—10%的二甲基亚砜（DMSD） 首先将细胞放入冷冻保护液进行预冷却，然后按1 ml/安瓶装瓶封口。
再放入慢冻机按每分钟下降1 ℃的速度缓慢冷冻至25 ℃ ，最后放入液氮 -90℃可保存6个月，-196℃几乎可无限期保存复苏复苏 迅速取出盛冰冻细胞的安瓶投入37℃水浴中，继而摇动安瓶使内容物在20-60秒内完全恢复悬液状态。