肠道病毒71型感染宿主固有免疫应答研究进展摘要：肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)感 染严重危害儿童生命安全其致病机理尚未完全明确 EV71感染既可以激活模式识别受体诱导机体的固有 免疫应答，病毒自身也进化出独特的机制逃避固有免 疫的杀伤此外，固有免疫应答也与EV71致病机理、 临床特点密切相关本文就以上方面的最新研究进展 进行综述及讨论关键词：肠道病毒71；固有免疫；信号转导；I 型干扰素；细胞因子肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)是除脊髓 灰质炎病毒外最重要的嗜神经型病毒之一主要感染 学龄前儿童，临床表现轻重不一，从轻微的手足口病 或疱疹性咽峡炎，到无菌性脑膜炎、脑炎、肺水肿和 死亡[1],目前尚无有效的药物和预防手段EV71引起 疾病不同临床表现的机制至今尚不清楚，推测与EV71 感染导致异常的免疫反应有关动物机体对病毒感染 的免疫应答分为固有免疫应答和适应性免疫应答两个 层次其中，固有免疫应答不但是机体抵抗病毒侵染 的第一道防线，而且负责启动和调节机体适应性免疫, 在整个抗病毒免疫反应中发挥着十分重要的作用［2］ 现就EV71感染宿主固有免疫应答的研究进展综述如 下。
1固有免疫与病毒感染固有免疫也称天然免疫，是宿主防御病原体入侵 的首道屏障主要通过胚系编码的模式识别受体（PRRs） 识别病原微生物保守的相关分子模式（PAMPs）,实现 对外来病原体的早期识别，进而启动固有免疫的效应 机制病原体入侵宿主，PRRs迅速激活，通过特异的 信号级联反应活化转录蛋白，从而诱导靶基因、促炎 细胞因子、I型干扰素（I型IFN, INF-a/B ）等的 表达，诱导感染部位产生炎症反应，吸引并激活巨噬 细胞（MC）和树状突细胞（dDCs）等免疫细胞，从而 清除病原微生物；同时上调抗原递呈细胞（APC）表 面共刺激分子的表达，诱导T或B淋巴细胞活化、增 殖、分化为效应T或B细胞，产牛病原特异性的适应 性免疫应答⑶固有免疫和适应性免疫在感染的各个 阶段协同作用，最终清除入侵的病原微生物病毒释放的PAMPs主要是核酸类物质，包括病毒 基因组 DNA、单链 RNA（ssRNA）、双链 RNA（dsRNA）、 5,三磷酸RNA和表面糖蛋白等⑶宿主PRRs主要有 四类⑷：Toll样受体家族（TLRs）、RIG-I样解旋酶受 体家族(RLRs )、核昔酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs) 的一些成员，以及ERIS (STING/MITA)等蛋白质。
PRRs 分布在不同类型的细胞，不同的PRRs识别不同的 PAMPs,并具有细胞特异性，激活不同的信号通路⑸已知哺乳动物有13种TLRs,表达在DCs、MC、 淋巴细胞及其他细胞TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要 识别病毒DNA及RNA成分，TLR2、TLR4识别病毒糖 蛋口⑶RLRs有三个成员：视磺酸诱导基因蛋口 I (RIG- I , DDX58, DEAD)、黑色素瘤分化相关基因5 (MDA5JFIH1)和遗传学和生理实验室蛋白2(LGP2), RLRs在包括免疫细胞和非免疫细胞表达，可以识别细 胞内RNA病毒成分⑶另外两类PRRs主要识别细胞 内 DNA[4]O2EV71感染的固有免疫识别体外和动物研究的结果表明，小RNA病毒EV71 与其他家族成员一样，通常由TLRs与RLRs识别其核 酸⑶GongX等⑹经RT-PCR证实，感染EV71的人单 核细胞源巨噬细胞(MDMs), TLR2、TLR7和TLR8的 表达显著增强，增强的IL-8和TLR2基因表达也在紫外 线失活EV71感染的MDMs发现，分析很可能是细胞 表面上的TLR2和病毒蛋白相互作用的结果，认为TLR2, TLR7和(或)TLR8参与了 EV71相关分子模式的识别。
虽未直接检测到TLR3表达增加，但另一研究观察到感 染细胞中TLR3信号通路的关键转录因子干扰素调节 因子3 (IRF3)下调和干扰素刺激基因(ISG)磷酸化 抑制，表明EV71和TLR3之间有关联⑺另外，EV71 3C蛋白酶(3Cpro)与RIG- I相互作用，随后破坏RIG- I依赖的I型IFN反应所需的RIG- I -IPS-1复合体［8］, 提示RIG- I途径可能参与识别EV71o最近，Kuo RL等 ⑼使用EV71 RNA作为激动剂，在基因敲除实验中显 示MAD5表达减少，IRF3的活化与IFN-BmRNA表达 相应降低，表明MDA5参与了 EV71的PAMP识别PRRs基因的多态性也可能是EV71感染的危险因 素有国内的学者［10］检测了 87例有症状的EV71患 者与57例无症状EV71感染对照组TLR3、RIG- I以及 MDA5的基因多态性，有序Logistic回归分析显示 MDA5 (rsl990760)的多态性与EV71感染的严重程度 相关提示通过调查EV71感染固有免疫机制，有可能 识别高危婴幼儿3 EV71感染宿主固有免疫信号转导及应答EV71与其他小核糖核酸病毒的RAN被免疫细胞 识别后，通过招募特异接头蛋白激活一系列信号级联 反应，诱导I型IFN和促炎细胞因子的产生⑶。
目前 公认的大部分TLRs通过髓样分化因子88 (MyD88)途径传导信号，进而活化白介素1受体相关因子激酶(IRAKs)和肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6), 最终激活IRF7和核因子-k B (NF-k B),诱导IFN-a等 细胞因子的表达而TLR3则通过干扰素TIR结构域衔 接蛋白(TRIF)途径(即MyD88非依赖途径)，一方 面通过激活 TBK1 (TANK-binding kinasei)或 IKK (I k B kinase)激酶复合体，活化转录因子IRF3或IRF7,最 终诱导I型IFN的表达；另一方面，通过激活IKKs活 化NF-kB,最终诱导一系列炎症因子的表达［4］RIG- I和MDA5识别双链RNA后，激活下游的接头蛋白 IFN-B 启动刺激因子(MAVS, IPS-1> VISA 或 Cardif), MAVS招募TRAF3或TRAF6形成功能复合体，从而进 一步激活激酶 TBKl/IKK-i 或 IKKSo TBKl/IKK-i 使得 IRF3 或IRF7发生磷酸化，诱导I型IFN的表达；而IKKs通 过激活NF-k B,诱导一系列炎症因子的表达⑷。
I型IFN的早期感应及活动，使细胞迅速建立抗御病 毒感染状态，抑制病毒复制及传播然而，EV71诱导 I型IFN产生的研究结果并不一致起初在小鼠模型 中发现，早期使用重组IFN-a A,保护小鼠对抗EV71 感染，而用抗IFN-a/B中和抗体预处理，则极大地提 高了小鼠对EV71的易感性，死亡率及组织病毒载荷增 加；虽然证实I型IFNs对EV71感染的保护作用，但 EV71接种没有引起小鼠血清I型IFNs增加[11],也不 能诱导人类MDMs释放IFN- a [6]临床上，传统的干 扰素治疗对EV71感染患者疗效轻微不过，最近一项 研究证明EV71感染过程中可适度刺激INF的生产，但 EV71诱导的INF或外源性INF治疗不能有效触发下游 信号级联反应以抑制病毒的复制[12]o对于这些矛盾 的结果，目前学者们公认与EV71进化了机制以逃避宿 主免疫杀伤有关细胞炎症因子的分泌是构成防御病毒的第一道防 线的重要部分，然而，也与EV71感染的发病机理密切 关联临床研究显示，EV71感染伴自主神经功能失调 患者IL-1B、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-a (TNF-a ) 的血浆水平升高[13],并发脑炎与肺水肿患者IL-1B、 IL-6水平显著高于无并发症的患者[14-16]o因此，升 高的IL-6可能代表了 IL-1B和TNF-a生物学作用的”网 络效应“。
近年陆续报告EV71感染患者血液和脑脊液 IL-10、IL-13> IFN-y、IFN-Y 诱导蛋白-10 (IP-10)、单 核细胞趋化蛋口 1 (MCP-1)、MIG (IFN-Y诱导单核因 子)、IL-1受体拮抗剂和粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 等增高，并与与EV71疾病严重程度相关[15-17],说明 由IL-6、IL-1B和TNF-a等介导的急性期蛋白和趋化因 子激活可能会加剧病毒诱导的炎症和病理学变化Khong WX等［18］用抗IL-6抗体治疗EV71感染的新生 小鼠，与对照组相比显著降低了死亡率和组织破坏程 度，而且这些保护作用不依赖于病毒载荷提示高水 平IL-6可能与EV71感染过程中的发病率和死亡率存在 因果关系，针对IL-6信号治疗可能是治疗重症EV 71 新的研究目标发育研究表明，固有免疫反应具有年龄依赖性的 特点，有些特定模式在生命的早期被表达，而成人型 模式在童年时才逐步建立［19］ o比如婴幼儿对感染信 号的固有免疫应答中，产生较高水平的某些促炎细胞 因子，特别是IL-6、IL-1B、IL-23,并表现出偏向Th2 和Thl7型辅助T细胞的反应，而抑制细胞内病原体重 要的Thl型细胞因子IFN- a和IL-12p70水平则较低［20, 21］o因此，最近有学者提出，由于免疫应答存在年龄 依赖性，那么，控制病毒复制不力，或优先产生病理 性免疫应答，或两者共同作用，可以解释EV72感染婴 幼儿严重病例和死亡率较年长儿高的现象［19］ o4 EV71感染对固有免疫的调节在DC等APC在通过PRRs启动抗感染免疫应答的 同时，病毒也通过进化出的各种机制来抑制PRRs介导 的信号通路，从而逃避宿主对病毒的免疫杀伤。
EV71 编码的的非结构蛋白3C> 2A、2C都参与了此类调节4.1 EV71 3Cpro几乎参与了病毒复制过程的所有 蛋白剪切，并针对宿主细胞固有免疫途径的多个组件, 导致I型IFN应答的抑制o3Cpro通过分解RIG- I -IPS-1 复合物和破坏IRF3核转位阻断RIG- I信令［7］；与TRIF 结合，在半胱天冬酶抑制剂(Z-VAD-FMK)存在的条 件下诱导其裂解，抑制其下游基因的表达⑻；直接切 割信号分子 TRAF3［22］、IRF7 ［23］、IRF9［24］3Cpro 还 裂解灭活多聚腺莒酸化系统裂解刺激因子(CSTF-64), 抑制宿主前体mRNA3-末端加工和多聚腺莒酸化，可 能会导致宿主细胞mRNA的成熟抑制［25］,有可能参 与抵抗细胞抗病毒应答，包括抑制病毒诱导的IFNB 产生4.2 EV71 2Apro另一个蛋口酶，新近研究证实， 它以RIG- I样受体MDA5为水解目标［26］,并通过靶 向切割在RIG- I和MDA-5激活的信号转导途径中的关 键接头分子MAVS［27］,有效封锁IFN-I转录的上游, 抑制I型IFN的产生Lu J等［12］还发现2PR0降低了 干扰素受体1 (IFNAR1)水平，阻止下游信号通路， 从而抑制ISGs的活化。
此外，2A pro可切割核孔蛋白 62 (Nup62),导致核孔复合物跨膜转运功能的障碍, 因而，可导致细胞因子、IFN等抗病毒蛋白的合成受 到抑制，从而无法有效的清除病毒，这可能是EV71逃避先天性免疫引起重症病例或死亡病例的重要机制 之一 ［28］4.3 EV71 2C可直接与IKK B相互作用，抑制IKKB的活化和I K Ba (IKK)的磷酸化/降解，从而抑制 TNF-a诱导的NF-k B的激活［29］以此调节宿主的固 有免疫反应4.4其他不久前刘颖等［30］用EV71 (VR1432)感 染Vero E6细胞后，进行干扰素刺激，发现细胞核内 磷酸化转录激活因子1 (STAT1)表达水平与胞质内相 比明显降低，表明EV71感染抑制I型IFN信号通路中 干扰素刺激基因因子 3 (IFN-stimulated gene factor 3, ISGF3, STAT1/STA。