《微生物工程》课程综述微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法学生姓名 学 号 学生专业 班 级 二级学院 成绩评定 评阅教师 年 月1微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法[ [摘摘 要要] ]介绍了常用微生物菌种的保藏方法，包括传代培养保藏法、载体保藏法、冷冻保藏法、真空冷冻干燥保藏法、蒸馏水保藏法等并介绍了其优缺点，为微生物菌种的保藏提供参考[ [关键词关键词] ]微生物；菌种；保藏方法The collection of microbial strains[Abstract]This article mainly introduces some commonly used methods of collecting microbial strains, including Culture collection, Carrier collection, Freezing collection, Vacuum freezing collection, Distilled water collection etc. This paper also explains these collections’ advantages and disadvantages to provide the references for collecting of microbial strains.[Key words] microbes ; strains ; collections1 引言菌种是国家的重要资源，是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产更离不开菌种。
所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其任务是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度[1]故本文就微生物菌种的常用保藏方法进行了介绍2 微生物菌种的保藏的基本原理菌种的保藏方法有很多，其原理主要是根据微生物的生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降至最低程度或处于休眠状态，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的[2,3]3 微生物菌种的保藏方法3.1 传代培养保藏方法即定期移植法包括斜面保藏法、穿刺保藏法等3.1.1 斜面保藏法斜面保藏法是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏将微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下培养并生长2良好后，放入 4~5℃冰箱中保藏，一般保存期为 3~6 个月，到期后须重新传种再行保藏对不同的菌种，其保藏的温度和时间并非绝对相同这种保藏方法的弊端在于短期内多次传代容易引起菌种发生变异，杂菌污染的机会也随之增多采用这种方法保藏菌种时，可以在可能的范围内减少碳水化合物的含量，或者将试管口更好地密封，减少培养基失水和杂菌污染，以延长保藏期[4]3.1.2 穿刺保藏法穿刺保藏法是斜面保藏法的一种改进，常用于各种好气性细菌的保藏。
其方法是配置 1%的软琼脂培养基，装入小试管或螺口小管内，高度1~2cm，121℃灭菌后，不制成斜面而使其凝固，用接种针将菌种穿刺接入培养基的 1/2 处经培养后，微生物在穿刺处和培养及表面皆可生长，然后覆盖约2~3mm 的无菌液体石蜡，放入冰箱保藏，可保藏 6~12 个月这种方法的适用范围较广，也可用于放线菌和真菌的保藏穿刺保藏法简便实用，但对不同的微生物种类保藏期有很大的差异如有的真菌可保藏 10 年之久对一些形成孢子能力很差的丝状真菌，液体石蜡保藏更有效[4]3.2 载体保藏法即干燥保藏法包括滤纸保藏法、沙土保藏法等3.2.1 滤纸保藏法将滤纸剪成小条，装入安瓿管中，塞以棉塞，121℃灭菌 30min将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使其充分生长灭菌脱脂牛乳 1~2mL滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽干将棉花塞入管内，用火焰熔封，低温保存细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏两年左右，有些丝状真菌甚至可保藏 14~17 年之久。
此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备[5]3.2.2 沙土保藏法取河沙过 40 目筛去粗粒后，用 10%盐酸浸泡 2~4h 以除去有机质，倒去酸水后用自来水冲洗至中性，烘干备用另取非耕作层的不含腐殖质的瘦黄土或红土，用自来水浸泡使其呈中性，然后烘干、碾碎过 100 目筛将处理好的沙与土以 2:4 的比例混匀,分装于小试管内，每管装 1g 左右，塞上棉塞，用牛皮3纸包好后于高压锅内 1.5kg/cm ²的压力下灭菌 30~45min灭菌后进行无菌检验，合格后使用将培养成熟的优良菌种（一般指孢子层生长丰满的菌种）用无菌水洗下制成孢子悬液，每支沙土管用无菌吸管加入悬液 0.5mL（一般以使沙土刚刚润湿为宜） ，塞好棉塞放入盛有干燥剂的真空干燥器内，用真空泵抽干水分抽真空时间越短越好，以免孢子萌发抽干的沙土管用无菌勺子捣松并每个种抽取 1 支回接于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长若经检查没有问题，则将制备好的沙土管用石蜡封口放入冰箱或室内干燥处保藏[2,6]此法多用于能产孢子的微生物，且保藏时间较长，但用于营养细胞效果不佳[2]3.3 冷冻保藏法包括普通冷冻保藏法、超低温冷冻保藏法、液氮冷冻保藏法。
3.3.1 普通冷冻保藏法（-20℃）即低温冰箱保藏法将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口，置于普通冰箱中保藏这一方法虽操作简单但不适宜长期保藏3.3.2 超低温冷冻保藏法（-70℃）将生长至对数生长中后期的微生物细胞，加入新鲜培养基使其悬浮，然后加入等体积的 20%甘油或 10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻管或安瓿管中，于-70 ℃超低温冰箱中保藏若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5 年而活力不受影响[7]3.3.3 液氮冷冻保藏法（-196℃）先将菌种制成悬液备用，然后清洗安瓿瓶并烘干，再往安瓿瓶中注入冷冻保护剂保护剂应根据被保藏微生物的类别选择，一般每瓶注入 10%~20%的甘油 0.8mL，塞上棉塞，放入高压锅内 1.5kg/cm ²的压力下灭菌 30~45min，检查无菌后接入菌种，火焰熔封瓶口将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，冷冻速度以 1min 下降 1℃为好，使其冻结至-35℃然后将冻好的安瓿瓶立即放入-150~-196℃的液氮罐中保藏此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法难以保存的微生物如支原体、衣原体，以及难以形成孢子的霉菌、噬菌体和动物细胞均可长期保藏，且性状不变异，但设备昂贵。
[2]3.4 真空冷冻干燥保藏法包括好氧菌冷冻干燥管的制备和厌氧菌冷冻干燥管的制备43.4.1 好氧菌冷冻干燥管的制备安瓿管用 2%盐酸浸泡过夜，用自来水冲洗并用蒸馏水浸泡至 ph 中性，烘干后加入脱脂棉塞，灭菌备用保护剂可选择血清、脱脂牛奶和海藻糖等将培养好的菌体或孢子加入保护剂制成菌悬液，分装于安瓿管中，每支 0.2mL然后放入冰箱冷冻 2h 以上，达到-20~-35℃左右再置于冷冻干燥箱内进行冷冻干燥直至其中水分被抽干，时间一般为 8~20h将安瓿管在真空条件下熔封，低温或常温保藏3.4.2 厌氧菌冷冻干燥管的制备主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在 100℃的沸水中煮沸 15min 左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧此法为菌种保藏方法中应用最广泛的，是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，几乎所有的微生物均可采用此法保藏适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年[2]方便之处在于因冷冻干燥管无需低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵[7]3.5 蒸馏水保藏法此法是将菌体悬浮在蒸馏水中进行保藏每试管装 5mL 的蒸馏水，塞好棉塞，灭菌。
用接种环取一环已培养好的细胞移入无菌蒸馏水中制成悬液，或斜面培养物上加 6~7mL 无菌蒸馏水制成悬液，然后移至试管中将棉塞改换成已灭菌的橡皮塞（螺旋盖更佳）或密封后于 10℃或室温下保存方法简单，适合用于酵母菌、细菌、放线菌和真菌的保藏[8]4 结语除了上述保藏方法外，还有固体化技术保藏法、生理盐水保藏法、自然基质保藏法等由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性所以，微生物菌种在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合的考虑所以对于一些比较重要的微生物菌种，要尽可能多地采用各种不同的方法对其进行保藏，最好是采用2 种以上的保藏方法，并根据菌种的特性定期对菌种进行复活检验，以免因某种方法的失败而导致该菌种的丧失[8,9]5 参考文献[1] 俞俊棠,唐孝宣,邬行彦,李友荣,金青萍.新编生物工艺学[M].北京:化学工业出版社,2003.[2] 吕线红,郭利美.工业微生物菌种的保藏方法[J].山东轻工业学院学报,2007.5[3] 武治昌.食用菌菌种保藏技术[J].农村科技开发.2004.[4] 曹军卫,马辉文,张甲耀.微生物工程[M].北京:科学出版社,2007.[5] 付美红,王耀耀,朱研研,郝慧云,刘云清,王亚莉.微生物菌种的保藏方法[J].河北化工,2010.[6] 黄日明.食用菌育种栽培加工技术[M].湖南:湖南科学技术出版社,1998.[7] 董昧.微生物菌种的保藏方法[J].河北化工,2009.[8] 中国工业微生物菌种保藏管理中心.[9] 许丽娟,刘红,魏小武.微生物菌种的保藏方法[J].现代农业科技,2008.。