大蒜多糖的提取分离及含量测定分析索朗桑姆 (西藏农牧学院林学系)摘 要 多糖是由单糖组成的天然高分子化合物到目前为止,已从自然界提 出好几百种多糖经过近十多年的大量研究证明,多糖有许多生物活性,尤其有 增强人体免疫能力和抗肿瘤的功能大蒜多糖是大蒜中的重要活性成分,本文 主要进行了大蒜多糖提取及分离纯化,并对得到的多糖作了初步的结构与性质 分析关键词 大蒜多糖 提取 分离纯化大蒜(AlliumSativumL1)又名胡蒜、 葫、 独蒜、 独头蒜,为百合科葱属植物由于它 富含生物活性成分和营养成分(见表1) ,五千多年前,人们就利用大蒜防病 《旧约 全书 — 古埃及记》 提到,古埃及人为了让奴 隶身体强壮,就让他们多吃大蒜我国使 用大蒜防病、 治病也有悠久的历史,《别 录》 、《古今注》 、《普济方》 、《本草纲目》 等均有记载,指出大蒜具有 “通五脏、 达诸窍、 去 寒湿、 避邪恶、 消臃肿、 化积食” 等功能现 代医学研究表明,大蒜还具有很多全新的 用途在当今返本求真、 回归自然的国际 食品潮流中,掀起了一股 “大蒜热” 1989年2月在西德召开了 “大蒜的化学、 药理和 应用专题讨论会”;1990年8月在美国召 开了 “大蒜的保健意义及其成分” 国际会议;1991年7月在美国又举行了一次 “大 蒜功能研讨会”,更加推动了这股世界热 潮。
大蒜是我国民间常用的食物,实验已 经证明它具有抗菌消炎、 抗血凝、 降血脂、 预防动脉粥样硬化、 保护肝功能和抑制肿 瘤生长等多方面的药理作用1990年8 月在美国召开的关于大蒜保健意义及其成分的首届会议证实了大蒜能在不同程度上 防治结肠癌、 膀胱癌、 皮肤癌和肝癌大蒜 多糖是蒜中有效成分,它集蒜的多种功能 于一身在药理作用方面,临床显示大蒜 多糖具有抗菌消炎、 抗血凝、 降血脂和预防动脉粥样硬化的功效有资料报道大蒜多 糖还具有抗糖尿、 保护肝功能、 抗肿瘤和预 防衰老等作用 表1 新鲜磷茎每100g含有成分Tablel 主成分 Major(g)水分 water蛋白 protein脂肪 Lipid碳水化合物 Carbohydrate粗纤维 Cellulose挥发油 Volstileoil 7041401223017012 微量成分 Minor(mg)钙 Ca磷 P铁 Fe硒(μg)Se锗 GeSOD5440144475141716 核黄酸尼克酸抗坏血酸硫氨素 01030193012422资源开发 《西藏科技》2004年4期(总第132期)1 材料试剂及仪器111 材料及试剂大蒜(西藏)、015 %草酸铵、 乙醚、 石油 醚、 冰醋酸,丙酮、 氨水、95 %乙醇、 无水乙 醇、 浓硫酸、 均为国产分析纯试剂,80 %苯 酚溶液、6 %苯酚溶液(临用前以80 %苯酚 溶液配制)DEAE纤维素、NaC1 ,葡萄糖、 木糖、 半乳糖、 树胶醛糖112 主要仪器 日本岛津FIIR—8001红外光谱议、JENWAY6305 UV/ VIS紫外分光光度计、 调 温电热套、8302型恒温水浴锅、 分析电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)、DHG—9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上 海益恒实验仪器有限公司)、PHS—2C型酸 度计、SJD28—5多功能电磨机、RE—52C 型旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)。
2 实验内容211 大蒜多糖的提取分离21111 大蒜多糖的提取大蒜的脱脂100g去皮大蒜,在酒精中捣碎,用尼 龙布过滤,用乙醚与石油醚等量混合物50mL ,回流2小时,冷却后尼龙布过滤,反复脱脂5次,残渣空气干燥,得棕色糊状物80114g015 %草酸铵提取 取棕色糊状物20g ,加入015 %草酸铵13111L ,在沸水浴上加热搅拌4小时,冷却后尼龙布过滤,上清液用冰醋酸酸化至PH415 ,用4倍体积酒精(约200mL)沉淀多 糖,得白色絮状沉淀(粘性) ,用布氏漏斗抽 滤,再用无水酒精、 乙醚依次洗涤3—4次, 干燥 得 白 色 无 定 型 粉 末(粗 多 糖A)114826g 大蒜粗多糖的纯化 大蒜粗多糖用Sevage法去蛋白质,将 粗多糖溶液中加入氯仿 — 正丁醇混合溶液(V氯仿:V正丁醇= 4∶1)充分振摇,将游 离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离 去除重复此过程多次,用紫外分光光度 计测其吸光度,去离子水做空白溶液,检验 除蛋白质情况在去蛋白质后的溶液中加 入2倍于溶液体积的95 %得乙醇进行沉淀,离心、 干燥,得去蛋白粗多糖21112 提取剂的选择实验用015 %mol/LNaoH、015 %HcI溶液和蒸馏水分别作提 取剂,计算大蒜多糖的得率,来进行提取剂 的选择,实验结果如表2所示。
表2 提取剂性质对大蒜多糖得率的影响次数Times015 %NaoH提取015 %mol/LNaoH solution015 %HcI溶液015Hcl solution蒸馏水Distilled Water粗多糖得率1161801813520127Crude polysaccharide2111671113319131rate( %)3131261514522134粗多糖得率平均值( %)131911510420164average crude polysaccharide rate32《西藏科技》2004年4期(总第132期) 资源开发在实验中发现,用NaoH和HcI溶液作 提取剂,浸提达到完全所需的时间较蒸馏 水稍短,但从表1—2看出,蒸馏水提取的 粗多糖得率明显较前二者高,这是因为稀 酸、 稀碱在浓度因子难以控制的情况下易 使多糖发生糖苷键的断裂,使部分多糖发 生水解而减少了提取得率因此采用蒸馏 水做提取剂较易操作,并有利于提高多糖 得率,故以下实验中均以蒸馏水做提取剂21113 用水代替草酸铵提取取另一部 分脱脂蒜泥4514027g ,用水浸泡一夜,用尼 龙布、 滤纸依次过滤,得棕黄色澄清液体。
用水提取可把其中的富半乳糖醛酸部分分 离出来,并获得富半乳糖部分的多糖21114 大蒜多糖的分级沉淀分离: 将上一步所得的棕黄色澄清液体用4倍体 积无水乙醇沉淀,得棕黄色粘稠状沉淀,即 多糖B过滤得浅绿色澄清溶液,旋转蒸 发浓缩,用3倍体积冷丙酮沉淀,有棕黄色粘稠状沉淀产生,干燥得棕黄色粉末,即多 糖C 多糖B加氨水调至PH815 ,室温搅拌4 小时,得浅黄色溶液约300ml ,加入5 %Ca2Cl2溶液10ml ,有白色絮状沉淀产生,离心干燥,得浅黄色粉末013134g上清液呈浅 黄色约350ml ,3次旋转蒸发浓缩,浓缩液加入4倍体积无水乙醇醇析,立即出现大 量白色冻状物质(多糖B1) ,过滤,静置一 夜后,大量冻状物质成为少量淡黄色粘稠 状物质上清液旋转蒸发浓缩,加入3倍 体积冷丙酮,有白色大小不等悬浮物出现, 过滤,离心,干燥得白色粉末,多糖B2 将多糖B1溶于适量的蒸馏水,加入95 %乙醇分级沉淀,得多糖相应的两个级 分B3和B4将收率较大的多糖B3溶于水制成饱和溶液,分别在两个DEAE纤维柱 上纯化,各用去离子水和015mol/LNaCl溶液洗脱,析唾液经分布收集器收集后,用质 量分数为012 %得硫酸 — — — 蒽酮检测,依 洗脱曲线合并洗脱液,加入无水乙醇沉淀, 干燥。
用去离子水洗脱则得精制多糖B5、B6,用015mol/LNaCl溶液洗脱则得精制多糖B7提取过程如图下所示图 从大蒜中提取多糖的流程图212 大蒜多糖的组成测定(酸水解产物的 纸层析) 多糖完全酸水解:分别称取大蒜各级 42资源开发 《西藏科技》2004年4期(总第132期)多糖约10mg ,加入2mol/LH2SO1各3ml ,充 氮气除氧气封管,放于100℃沸水浴中水 解10小时,水解液经BaCo3中和后,过滤, 旋转蒸发器浓缩,作纸层析 采用普通滤纸,上行层析,溶剂系统为正丁醇:冰醋酸:水(4∶1∶5)或醋酸乙酯:吡 啶:水(10∶4∶3) ,三者约100ml浓缩后点 样、 展开、 显色,显色剂为苯胺 — 邻苯二甲 酸并用木糖、 半乳糖、 葡萄糖等标准单糖 作为对照213 糖的含量分析:(苯酚 — 硫酸法)21311 标准曲线的测定精密称取标准 品(分析纯无水葡萄糖,105℃ 干燥至衡重)1010mg ,用蒸馏水溶解后定容到1010 ,精密 称取110ml ,用蒸馏水稀释定容至1010mL ,得标准溶液(100μg/ mL)取8只大试管,分别加入110、019、018、017、016、015、014、013mL蒸馏水,再加入010、011、012、013、014、015、016、017mL标准溶液,然后在每只 试管中加入110mL015 %苯酚水溶液,摇匀后再加入510mL浓H2SO4,放置10分钟, 摇匀,静至20分钟后,于490nm处测吸光 度,以糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标, 得葡萄糖标准曲线。
再分别精密称取标准品甘露糖、 半乳糖等标准单糖,依上述步骤作出各种单糖 的标准曲线21312 样品含量测定精密称取多糖510mg ,用蒸馏水溶解后定容到100mL ,得样品溶液50μg/ mL称取样品液110mL , 测出490nm波长下的吸光度,查得标准曲 线的糖含量214 多糖的光谱分析 红外光谱测定时取约2mg多糖,与100～200mg经干燥的K Br粉末在玛瑙研 钵中研细后压片测定 紫外光谱测定时,将多糖配成500μg/mL的溶液,用紫外分光光度计在不同波长 下测其吸光度,制得吸收曲线根据红外光谱和紫外光谱的测定结果进行分析3 实验结果与讨论311 大蒜粗多糖的溶解性实验 三种多糖A、B、C各取少量分别加入 水、 乙醇、 乙醚、 丙酮等有机溶剂中试验,结 果都只溶于水,不溶于乙醇、 乙醚、 丙酮等 有机溶剂中312 多糖中糖含量的测定 多糖粗多糖用苯酚-硫酸法测得样品 在490nm处的吸光度为01456求得葡萄糖 含量为9151 %4 多糖组成与结构分析411 红外光谱分析 分析结果如图所示,比较大蒜多糖A、B、C的红外光谱图,可见三者基本是一致的在4000～650cm- 1呈多糖类物质的特 征吸收峰。
测定结果表现出该多糖的特征 吸收峰如表3所示表3 多糖特征吸收峰比较多糖种类特征吸收峰cm- 1A34241131731329281323571316351814021410281284412B342719314812292614235314162811140214102413C33931229301223571316301014041411261610341093516846135991952《西藏科技》2004年4期(总第132期) 资源开发3500—3200cm- 1的特征峰是由O—H的伸缩振动引起的;3000—2800cm- 1之间的尖峰是由糖类C—H得伸缩振动引起的,1400—1200cm- 1的一些峰是C—H的变角振动,这两组峰是糖类的特征吸收峰;1665—1625cm- 1是糖的水化物的吸收峤;1250—950cm- 1之间的一组峰是两种C—O的伸缩振动引起的,一种是吡喃糖环的醚键C—O—C ,另一种是羟基的吸收峰;102812cm- 1、103410cm- 1及1024513cm- 1两个吸收峰表征吡喃糖基,表明多糖的组成单糖为吡喃单体840和890处的若吸收峰分别是α和β糖苷键的特征吸收,多糖A、C在84412cm- 1和84613cm- 1有吸收,表明多糖A、C中有α糖苷键存在,三个级分中均未发现β糖苷键存在。
412 纸色谱木糖显红色,树胶醛糖显黄绿色,甘露糖、葡萄糖、 半乳糖均显棕色标准单糖的Rf比为葡萄糖:木糖:甘露糖= 0184∶1116∶1100多糖A在纸上只检出葡萄糖、 木糖、半乳糖的斑点,可能是因为。