临床免疫学检验第二十二章流式细胞仪分析技术及 应用第二十二章流式细胞仪分析技术及应用本章要点1. 流式细胞仪的分析及分选原理2.数据的显示与分析3. 流式细胞仪免疫分析的技术要求4.流式细胞术在免疫学检查中的应用概述：流式细胞术(FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞 理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术流式细咆仪的发展综合了激光技术、计算 机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知 识流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为-•体 的高科技细胞分析仪第一节流式细咆仪的分析及分选原理流式细胞计的基木结构流式细胞计主要由四部分组成它们是：流动室和液流系统；激光 源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统一、工作原理(―)基木组成结构1. 流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透 明、稳定的材料制作设计和制作均很精细，是液流系统的心脏样品管贮放样品，单个 细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外 周后从喷嘴射出为了保证液流是稳液，一般限制液流速度＜10m/sc由于鞘液的作用， 被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动2. 激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收 集检测常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以觎离子激光器为普遍，也有配合氟高子 激光器或染料激光器光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定觎离了激光器的 发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nni的谱线最强，约占总光强的80%；氟离子激光器光 谱多集中在可见光部分，以647nm较强免疫学上使用的一•些荧光染料激发光波长在 550nm以上，可使用染料激光器将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器 的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器例如用觎离子激光器的绿光亲浦含有 Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550〜650nm连续可调的激光，尤在590nm 处转换效率最高，约可占到一半为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上 的激光光斑直径应和细咆百•径相近因此需将激光光束经透镜会聚色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长入，为了进一步使检测的发射荧光更 强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片带阻或带通滤片是有选择性 地使某一滤长区段的光线滤除或通过。
例如使用525nm带通滤片只允许FITC （异硫敏荧光素）发射的525nm绿光通过长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开3. 光电管和检测系统：经荧光染色的细咆受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的光电倍增管（PMT）最为常用PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200〜900nm的光谱区，光量子产额都比较高光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大一般功耗低于0. 5W；最大阳极电流在几个亳安此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同，不宜互换也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器流式细胞计中一般备有两类放大器一类是输出信号辐度与输入信号成线性关 系，称为线性放大器。
线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过 程的信号，如DNA测量等另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关 系在免疫学测量中常使用对数放大器因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强 阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1〜2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对 数放大器采集数据易于解释此外还有调节便利、细咆群体分布形状不易受外界工作条件 影响等优点4. 计算机和分析系统:经放大后的电信号被送往计算机分析器多道的道数是和电信号的 脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的对应道数年纵坐标通常代表发出该信号 的细胞相对数U多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文 件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用计算机的存贮容量较大， 可存贮同一•细胞的6〜8个参数存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数 据处理和分析最后给出结果除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装 置二）基本工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸 缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就 能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依 次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源经过聚焦整形后的光束，垂直照射 在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光这两种信号 同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收光散射信号在前向小角度进行检 测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一 系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号.这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增 管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别 的数字信号计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏 幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分 析检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择单参数数据以直方图的形式表 达，其X轴为测量强度，Y轴为细咆数目一般来说，流式细咆仪坐标轴的分辨率有512 或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定对于双参数或多参数数据，既可以单 独显示每个参数的直方图，也可以选择二雄的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视 图二、散射光的测定散射光信号的产生是细咆在液柱中与激光束相交时向周围360度立体角方向散射的光线信 号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的 方向也有关。
流式细胞仪中涉及的散射光信号分为前向散射光和侧向散射光散射光不依 赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）1） 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，通常在FCM应用中，选取FSC作 阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰2） 侧向的散射：侧向角散射是指与激光束正交90度方向的散射光信号，侧向散射光对 细胞膜、咆质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细咆内精细结构和颗粒性质的信息三、 荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发 光波长不相同每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又会产生特定波长荧光和颜 色，例如绿色、红色、黄色等当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号一•种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特 异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分 析就能了解所研究细胞参数的存在与定量荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们 分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑 仪器所配置光源的波长，目前台式机FCM常配置的激光器为488nm通常可用染料有PI、 PE、FITC、PerCP、CY5 等。
四、 细胞分选原理细胞的分选是通过分离含有单细咆的液滴而实现的在流动室的喷口上配有一个超高频电 晶体，充电后第2页振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中将这些液滴 充以正负不同的电荷，当液滴流经带有儿千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转， 落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离分选指标主要包括：分选速度、分选纯度、分选收获率及分选得率1. 分选速度：指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式机的分选速度为300个/秒，大型 机的最高分选速度可达每秒上万个细胞2. 分选纯度：指被分选出细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到 99%左右3. 分选收获率：指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比通常情况下，分选纯度和收 获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然这是由于样品在液流中并不是等 距离一个接着-•个有序地排着队，而是随机的，因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在 强调纯度和收获率不同条件下，仪器会作出取或舍的决定，因此，选择不同模式要视具体 实验要求而定4. 分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出由KJ细胞的总量，再经分选后获得到目的细 胞的实际得率。
该得率与分选得速度密切相关第二节数据的显示与分析峰值脉冲信号：指的是脉冲的高度面积脉冲信号：指的是电压脉冲曲线内区域的大小一、 参数流式细胞仪的数据参数是指仪器采集的用于分析的信号，包括：前向散射光：反映颗粒的大小侧向散射光：反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度荧光：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据仪器的不同配置，同一•颗粒上可以同时 检测多种荧光信号二、 数据显示方式流式细咆仪的数据显示方式有如下几种：(-)单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分 析，形同 般X-Y平面描图仪给出的曲线根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性 标度或对数标度用“信道”来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度纵坐标-•般 表示的是细胞的相对数只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性1) 双参数直方图双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形常见有以下三种：1. 二雄点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系横坐标和纵坐标分别为与 细胞有关的两个独立参数，平面上每一•个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在可以由 二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一 维宜方图的信息量。
所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个 点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构2. 二维等高图：类似于地图上的等高线表示法它是为了克服二维点图的不足而设置的显 示方法等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”曲线层 次越高所代表的细胞数越多一,般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集 则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡3. 假三维图：是利川计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法它把原二维图 中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观 察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个 直方图、二维图和假三维图来完成的。