一）实验前应明确的问题1 选择适当的细胞接种浓度一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检 测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞 数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈 的线性关系否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异 药物浓度的设定一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛根据 自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是 药物的有效浓度和时间.3 时间点的设定.在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制 率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就 是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显） 培养时间200ul的培养液对于10的4〜5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果 营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液 的 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数.做MTT时，尽量无菌操作， 因为细菌也可以导致MTT比色0D值的升高。
6 理论未必都是对的要根据自己的实际情况调整 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜对照孔 和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而 加药组加入不同浓度的药物 避免血清干扰用含 15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的 光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此,一般选小于10％胎牛血清的培养液进行 在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液二）实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）.2 5%CO2, 37°C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物，原则上， 细胞贴壁后即可加药,或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药一般5—7个梯度，每孔100ul,设3-5个复孔•建议设5个，否则难以反应真实情况.3. 5%CO2，37°C孵育16—48小时,倒置显微镜下观察4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即05%MTT）,继续培养4h若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液.6. 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解在酶联免疫 检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1） 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1X106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度,1： 10 —1:20）;③需检测物10ul；④细胞悬液50ul （即5X104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边 缘孔用无菌水填充）每板设对照（加100?（储存液100 1640）2） 置 37C， 5%CO2 孵育 16—48 小时，倒置显微镜下观察3） 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml, 即卩0.5%MTT）,继续培养4 h悬浮细胞推荐使用WST—1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各 孔的吸光值）4） 离心（1000转x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振 荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光 值5） 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、 培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔三）MTT的配制MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在一20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以 免分解我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加,没必要一 下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了MTT有致癌性，用的时候小 心,有条件最好带那种透明的簿膜手套•配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感;往96孔板加 时不避光也没有关系,毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉配 制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配,60°C水浴助溶PBS 配方：Nacl 8g, Kcl 02g, Na2HPO4 144g, KH2PO4 024g,调 ph 7.4,定容 1L四） 关于细胞的接种（铺板）细胞过了 30 代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板）,不好 的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞 密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性 关系最好,结果最可信如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因 为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过 慢，其增值率线性关系不佳故而MTT细胞密度多采用10000/ml, 100ul/孔细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点 的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区 别更明显,数据更好悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103—104.（五） 加入 MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具 体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加 好一些MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了如果不使用96孔板， 培养基超过100ul, MTT按照10%的比例加入加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混 匀，不过这个应该关系不大.如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大，另外MTT稀釋後加 入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加 MTT 前可以先在镜下观察,看看是否有孔 染菌，染菌的孔常常是临近的。
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应,所以可以 单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应如果不起反应，就不用去除含药物的培液 直接加MTT即可首先说说我的一点经验：1吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀10ml的离 心管里面最好装 3~4ml 的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞 悬液.2. 吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这 样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀.如果是吸液量 1ml 多 的吸管,总液量在 5ml 左右为益3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹 打出气泡4. 吹打次数 100 左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 30－50 次基本就差不多 均匀了加细胞的时候每接种2 孔反复吹打 3 次，每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲 力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑 制,影响细胞的生长。
所以速度不能太快也不能太慢.我习惯每块板加完后平握手中，向左 3 下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些铺板技术是MTT 实验的关键，也是基础，一定要练好曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了， 建议不要采用这种方法混匀细胞.其它的声音：1 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔 1000 个左右就够了，我认为宁少勿多.尤其是对于肿瘤细胞10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的， 最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大.2 MTT 本身就是比较粗的实验，增殖率 10%左右的波动都不算奇怪特别是新手,20％的 波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验,这种细胞长的很快一开始我是用 100000/ML 的浓度来接 种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系 •后来调整浓度,用过40000〜 80000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是60000〜70000/ML的浓 度组的.用 40000/M 的浓度的组，由于细胞少,药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性 关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培 养时间是 48 小时还是 72 小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来,导致每孔中 的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。
加样器操作要熟练，尽量避免人为误差 虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟， CV 会在 8％左右.另外，吹散次数过多 也会影响细胞活力.所以要熟练些、快些上板。