碱性磷酸酶米氏常数的测定[目的与要求]通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义学会运用标准曲线测定酶的 活性，加深对酶促反应动力学的理解源理]在环境的温度、pH和酶的浓度一定时酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反 应开始时酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加若继续增加底物浓度，反 应速度的增加率将减少当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最 大反应速度(Vmax)，如图37所示底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示V = Vmax[S]/(Km+[S])上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelis constant)， 而其中V则表示反应的起始速度当V= Vm /2时，kJ = [S]所以米氏常数是反应速度等于 最大反应速度一半时底物的浓度因此K的单位以摩尔浓度(mol/L)表示Km是酶的最重要的特征性常数，测定R值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的 七值在 0.01-100(mmol/L)间 ""酶促反应的最大速度 Vmax实际上不易准确测定，Km值也就不易准确测出。
林-贝 (lineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = (Km +[S]) / Vmax[S]或 1/V = Km/ Vmax - (1/[S]) +1/ Vmax此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1 /V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确求得该酶的Km 值，如图38所示 " "图37底物浓度对反应速度的影响 图38 Lineweaver-Burk作图法本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作 图，计算其Km值可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值 本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件 下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醍衍生物，颜色深浅和酚的含量 成正比根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而 算出酶活性的大小反应式如下：AKPOH I N斗HE以I尸、匚顷一N C-Ot.：H 广｛ —C —N <^>= CIS衍生物(红色)时,a OH CH.-N C —。
II CH'-c-c- nh24氨峨安替比林［操作步骤］1. 底物浓度对酶促反应速度的影响(1)取6支试管，作好标记按下表操作试剂(mL)123 号 4560.04mol/L基质液0.100.200.300.400.800.0pH10, 0.1mol/L碳酸盐缓冲液0.700.700.700.700.700.70蒸馏水1.101.000.900.800.401.2037C水浴中保温5分钟血清0.100.100.100.100.100.10最终基质浓度2.004.006.008.0016.000.00(2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37°C水浴中准确保温15 分钟3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应4) 各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.OmL，0.5%铁氰化钾2.0mL，充分混匀， 放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活 性5 )以各管基质浓度的倒数1/［S］为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的 倒数1 /V作纵坐标，作图求出Km值2. 酚标准曲线的绘制(1)取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
试剂(mL)1234560.1mg/mL酚标准溶液0.00.050.100.200.300.40蒸馏水2.01.951.901.801.701.6037C水浴保温5min碱性溶液1.101.101.101.101.101.100.3% 4-氨基安替比林1.01.01.01.01.01.00.5%铁氤化钾2.02.02.02.02.02.0(2) 混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色3) 以酚含量(ug)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线［结果与计算］在37C保温15分钟，每生成1 mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量 (ug)即可算出酶活性100mL血清中酶活性=释放的酚量X(1/0.1)X100X(1/1000) ［注意事项］1. 血清取量要准确2. 标准曲线必须是过原点的一条直线［试剂］1. 0.04mol/L基质液 称取磷酸苯二钠10.16g或无水磷酸苯二钠8.72g,用煮沸冷 却的蒸馏水溶解，并定容至1000mL，加入4mL氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一 周2. 0.1mol / L碳酸盐缓冲液pH10(37°C) 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
3. 碱性溶液 取0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaHC03各20mL，混合后加蒸馏水到 100mL4. 0.5%铁氰化钾 取铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400mL蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶中，暗处保存5. 0.3% 4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及NaHC03 4. 2g用蒸馏水溶解，并稀释至100mL，置棕色瓶中，4C保存 36. 酚标准液(0.1mg/mL)a.称取结晶酚1.50g，溶于0.1mol / L HCl，定容至1000mL为贮备液b标定：取25mL上述贮备液，加0.1mol/LNaOH55mL，加热至65C再加入0.1mol/L 碘液25.0mL，盖好放置30分钟，加浓HCl 5mL，再以0.1%淀粉作指示剂，用0.1mol / L 硫代硫酸钠滴定，反应如下：3I2 + C6H5 ► 卬顷 + 3HII2 +2Na2S2 ► 2NaI + N^SQ根据反应，3分子碘(Mw： 254)与一分子酚(Mw：94)起作用，因此每毫升0.1mol/L碘液 (含碘12.7mg)相当于酚的毫克数为12.7X94/ (3X254) =1.56725mL碘液中被硫代硫酸钠滴定者为xmL，则25mL酚溶液中所含酚量为：1.567mgX (25-x)。
c.应用时，按标定结果用蒸馏水稀释至0.1mg/mL作为标准液［器材］1. 37C水浴 2.可见光分光光度计。