设计性实验报告设计性实验报告2012-2013 学年学年 第一第一 学期学期课程名称：课程名称：生物化学生物化学 题题 目：目：牛血清清蛋白的鉴定牛血清清蛋白的鉴定 院院 系：系：基础医学院基础医学院 班班 级：级：2011 级级 k-3 班班 姓姓 名：名：余国清余国清 学学 号：号：1120150305 日日 期：期：2012-12-02 实验目的：实验目的：通过牛血清清蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、透析、电泳、及呈色反应的原理及应用实验原理：实验原理：应用相同浓度硫酸铵反复盐析法，将血清中的清蛋白与其他球蛋白分离，再利用透析法除盐，即可提取清蛋白再利用电泳技术，即可对牛血清清蛋白进行分离与鉴定 实验步骤：实验步骤：1.1.盐析盐析 取离心管一支加入牛血清待测液 2 ml、加入等量 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入 pH7.2 饱和硫酸铵溶液 4 ml，边加边摇，然后再 2000 r/min 离心 10 min，将上清液倒入试管中，留供后面实验用。
2.2.透析透析 去玻璃纸（15cm*15cm）一张，折成袋形，将前面第一次盐析得到的含清蛋白的上清液倒入袋内，用线绳扎紧上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸馏水中，对蛋白液进行透析，并用玻璃棒搅拌袋外液体，以缩短透析时间还应经常换水，并用纳氏试剂检查袋外液体的 NH4+，观察颜色变化，直至袋内 NH4+透析完毕将袋内液体倒入试管，既得牛血清清蛋白溶液3.3.电泳电泳 ①.点样 取一条 2.5cm*8cm 膜条，将无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的无光泽面距一端 1.5 cm 处作为点样线，将牛血清样品与待测的牛血清清蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样②.电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极，待平衡 5 min 后，即可通电用 160 伏电压通电 60 分钟，通电完毕后，用镊子将膜条取出③.染色 将膜条直接浸于盛有氨基黑 10B 的染液中，染 2 min 取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗 5 min，直至背景漂净为止，用滤纸吸干薄膜。
4.4.鉴定鉴定 比较样品与待测液中清蛋白在薄膜上的电泳结果，比较位置是否一致预期结果预期结果：：如果醋纤膜上的色带位置一致，则说明提取的清蛋白得到了纯化；若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的色带区域，则说明清蛋白的提取不够纯实验仪器：实验仪器：名称名称规格、型号规格、型号数量数量说明说明普通离心机普通离心机1 1离心血清离心血清电泳仪电泳仪1 1检验清蛋白检验清蛋白离心管离心管2 2装盐析血清液装盐析血清液醋纤膜醋纤膜2.5cm*8cm2.5cm*8cm1 1电泳电泳玻璃纸玻璃纸15cm*15cm15cm*15cm1 1透析清蛋白透析清蛋白烧杯烧杯1 1透析透析试管试管2 2装清蛋白装清蛋白滴管滴管2 2加试剂加试剂玻璃棒玻璃棒1 1搅拌搅拌比色瓷盘比色瓷盘2 2检验检验 NH4+天平天平1 1平衡离心管平衡离心管实验试剂：实验试剂：名称名称规格、型号规格、型号数量数量说明说明牛血清标准液牛血清标准液2ml2ml牛血清待测液牛血清待测液2ml2mlPBSPBS稀释血清稀释血清纳氏试剂纳氏试剂检验检验 NH4+氨基黑氨基黑 10B10B 染色液染色液染色染色巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液浸透薄膜浸透薄膜漂洗液漂洗液ⅠⅠ漂洗漂洗漂洗液漂洗液ⅡⅡ漂洗漂洗漂洗液漂洗液ⅢⅢ漂洗漂洗硫酸铵硫酸铵pH7.2pH7.2盐析盐析附表：附表：PBSPBS 试剂：试剂：用 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的 0.9% NaCl 溶液。
pH7.2pH7.2 饱和硫酸铵：饱和硫酸铵：用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调到 pH7.2漂洗液：漂洗液：95%乙醇 45 ml，冰醋酸 5 ml，蒸馏水 50 ml氨基黑氨基黑 10B10B 染色液：染色液：氨基黑 10B 0.5g,甲醇 50 ml,冰醋酸 10 ml,蒸馏水 40 ml巴比妥缓冲液：巴比妥缓冲液：巴比妥钠 12.76g,巴比妥 1.66g，用少量蒸馏水加热溶解后，再加水稀释至 1000 ml纳氏试剂：纳氏试剂：溶解碘化钾 30g 于蒸馏水 20ml 内，再加入碘 22.5g 振摇使其溶解于此碘液内加入纯汞 30g，用力摇振之，待温度升高时，将烧瓶浸于冷水内，并继续摇匀，直到暗棕碘色转变为淡黄绿色为止将上层溶液倾出，置于量筒内，并以蒸馏水少许洗涤烧瓶，将洗涤液一并倾入吸取此配成之溶液 1 到 2 滴，加入 1%可溶性淀粉溶液 1 ml 内，以试验有无多余的碘存在，如不显蓝色（即无多余碘存在） ，可加入碘液（碘化钾3g，碘 2.5g 溶于蒸馏水 10 ml 内配成）数滴于配成之溶液内，直至此液加于淀粉溶液内初显蓝色为止；将此液以蒸馏水稀释至 200 ml，加 10%氢氧化钠溶液 975 ml，混合，即成纳氏试剂。
试剂新配成呈现混浊，静置数日，待其沉淀，再吸上清液供用参考文献：参考文献：[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安：第四军医大出版社，2010[2]黄诒森,张光毅.生物化学与分子生物学.第 2 版.北京：人民卫生出版社，2008[3]钱士匀.临床生物化学与分子生物学检验实验指导.第 2 版.北京：人民卫生出版社，2006[4]郭尧君.蛋白质电泳实验技术.第 2 版.北京：科学出版社,2005。