DNA连接实验原理（2008-03-31 18:21:51）转载标签：dna连接实验原理杂谈D N A分子的体外连接就是在一定条件下，由D N A连接酶催化两个双链D N A片段组邻的5，端磷酸与3，端疑 基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，D N A分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的带有相同末端（平端或粘端）的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源 DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以 便使''正确”连接产物的数量达到最住水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5,磷酸基团以抑制载体DNA的自身 环化利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5,磷酸和相邻的3,轻基Z 间形成新的共价键如载体的两条链都带有亍磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱 磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复1、 不对称粘性末端:两种限制酶消化厉,需纯化我体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点 常可保阳；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
2、 对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载休与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留； 重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载;体中3、 平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA 的串联拷贝；非重组克隆的背景较高粘性末端连接：实验试剂： 用适当的限制酶消化质粒和外源DNA如有必耍，可用凝胶电泳分离片段并（或）川碱性磷酸酶处理质粒DN Ao通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DN A,然后用TE（pH7.6）溶液使其浓度为100/mL10xT4DNA 连接lW buffer （该缓冲液应分装成小份，贮存于一20°C : 200mMTris-HCl（pH7.6）； 50mMMgC12； 50mM二硫节糊醇； 500gl/ml BSA （可用可不用）T4DNA连接酶5mM ATP实验步骤：1、 在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1） 10pl体积反应体系中：取载体50-100ng,加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA 分子摩尔数为1 ： 1-1 ： 5）,补足ddH2O至8』。
2） 轻轻混匀，稍加离心，于45°C水浴5分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴3） 加入含ATP的lOxBuffer lph T4 DNA连接酶合适单位,用ddH2O补至10pL2、 盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心5秒3、 12 °C下过後连接反应4、 反应结束后于一 2 0°C保存5、再设立两个对照反应，其中含有（1 ）只有质粒载体；（2 ）只有外源DN A片段如果外源DN A量不足, 每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10卩1可用 至少3种不同方法來测定T 4噬菌体DNA连接酶的活性注意事项：1、 连接反应的温度：DN A连接酶的最适反应温度为3 7C,但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定， 折衷方法是1 2 C过夜2、 DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端 连接和粘性末端连接二者连接效率不同粘性末端效率高，因而在底物浓度,酶浓度选择上是冇差异的3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加币;组子比例这样就会出 现DN A自生连接问题,为此通常选择对质粒载体用緘性磷酸酶处理,除去其5,末端的磷酸基，防止环化，通过 接反应后形成的缺U可在转化细胞后得以修复。
4、 连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过卜•一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定5、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的XDNAo若连接成功，则说明有效 连接反应的影响因素：1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris・HCI,较多用50mmol/L, pH的范围 在7.4-7.8,较多用7.8,目的是提供合适酸碱度的连接体系:10mmol/L的MgCI2,作用是激活酶反应；l・20mmol/L 的DTT,较多用10mmol/L,作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA,作用是增加蛋门质的浓 度，防止因蛋白浓度过稀而造成肠的失活与限制側缓冲液不同的是连接嗨缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP, 现多用lmmol/L,是酶反应所必需的°2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到747.8,较多用7.8有实验表明,若把pH为7.5-8.0时的酶活力定 为100%,那么体系偏碱（pll为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PII为6.9）时仅为全部活力的40%3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L Z间，较多用lmmol/Lo研究发现，ATP的最适 浓度为0.5-lmmol/L,过浓会抑制反应。
例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被 抑制；还有报道，当ATP的浓度为O.lmmol/L时，去磷酸载体的自环比例扱大由于ATP极易分解，所以当连 接反应失败时，除了 DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素含有ATP的缓冲液应于・20°C保存，溶化収用 后立即放回连接缓冲液体积较人时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解与限制酚缓冲液不同的是， 含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新 配制的ATP母液4、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间冇氢键的作川，所以温度过高会使岂键不稳定，但连 接酶的城适温度又恰为37°C为了解决这一矛石，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16°C,时间为4-16h 现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20°C 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话， 20°C 60min能使连接反应进行得更完全一些对于平末端是不用考虑爲键问题的，可使用较高的温度，使酶活力 得到更好的发挥5、 酗浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大 10-100倍。
进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀解液中的酶能在长时间 保持活力，也便于随时取用6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过壽，-•般不会超过20nmol/L要求线 性化的连接产物，DNA的浓度可以再些，至少是接近推荐的浓度在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在 双酚切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，茯至绘DNA的总浓度低至儿个nmol/L0另据研究，T4 DNA连 接酶对DNA末端的表观Km值为l.5nmol/L,所以，连接时DNA浓度不应低于Inmol/Lo即应具有2nmol/L的 末端浓度。