新疆农业大学硕士学位论文连作和轮作棉田土壤微生物多样性分析及PGPR菌株筛选姓名：张静文申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：罗明20090601连作和轮作棉田土壤微生物多样性分析及P G P R 菌株筛选摘要通过培养法和免培养法相结合研究棉花连作、轮作栽培体系下土壤微生物多样性的演替特点，揭示棉田连作障碍的生物因子，了解棉花连作、轮作体系中土壤微生物性状的现状和趋向并通过筛选具防病促生功能的P G P R 有益微生物菌群调节改善棉田生态环境，为探讨综合治理棉田连作障碍的有效措施，推动棉花种植结构的优化调整，保障棉花产业的健康、持续、高效发展提供科学基础和技术支持研究结果表明，棉花多年连作造成土壤中可培养微生物数量减少，连作6 ．8 a 、9 ．1 2 a 、> 1 3 a 的棉田与连作 1 3 a 与 1 3 a ) ；⑤连作8年棉田倒茬番茄( 棉花一番茄) ；⑥连作8 年棉田倒茬玉米( 棉花一玉米) ；⑦连作8年棉田倒茬草木樨( 棉花一草木樨) ；⑧连作8 年棉田倒茬春麦( 棉花一春麦) 各处理重复3 次，随机区组排列棉花采用地膜栽培，一膜2 行，播种前施基肥，常规管理表1 ．1 供试土壤的基本性质T a b l e ．1 ．1F u n d a m e n t a lc h a r a c t e r i s t i c so fs o i li nt h es t u d i e ds i t e s连作和轮作棉m + 壤徽争物多章芋性分析及p G P R 蔼抹筛选1 ．1 ．2 土样采集各处理区根据棉花及倒茬作物的生育期按5 点取样法采集0 ．2 0c m 耕层混合土样。
采样时间分别为：①2 0 0 7 年5 月1 6 日；②2 0 0 7 年6 月1 7 日；③2 0 0 7 年7 月2 4 日；④2 0 0 7 年8 月2 3 日；⑤2 0 0 7 年9 月2 9 日新鲜土样装入保鲜袋内，低温冷藏迅速带回实验室分析1 ．1 ．3 试验方法1 ．1 ．3 ．1 微生物总数及三大类群微生物区系土壤微生物区系分析按照《土壤微生物分析方法手册》[ 6 1 1 进行细菌、放线菌、真菌数量的测定采用稀释平板测数法，培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号、马丁氏培养基I ．1 ．3 ．2 微生物氮素生理群氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、好气性自生固氮菌等生理群微生物的测定采用最大可能数值( M P N ) 法【6 2 1 1 ．2 结果与分析1 ．2 ．1 土壤微生物总数变化测定结果显示( 图1 ．1 ) ，随着棉花连作年限的增加，土壤微生物数量呈现逐渐下降的趋势连作6 ．8 a 、9 ．1 2 a 、> 1 3 a 的棉田与连作 1 3 a 的较连作 1 3 a 的较连作 1 3 a 的棉田与连作1 35 ％％一t ∞6 * # 一Ⅲ№7 镕# 一4 $ * $ * # 一# ￡) ．T 目． M ：D N A M a r k e r 删椭d Ⅲ) ，l a M 】s ：I 1 3y e a t sc o n t i n u o u sc r o p p i n go f c o t t o n , 5 ．c o t l o n - t o m a t or o t a t i o n ；6 ．c o t t o n - c o r nr o t a t i o n ：7 ．∞瞰m —s w 嘟c l o v e rr o t a t i o n ；8 ．c o t t o n - w h e a tr o t a t i o n ．3 ．2 - 2 变性梯度凝胶电泳图谱分析( D G G E )D G G E 图谱中条带的数量、信号强弱( 灰度) 可以反映样品中菌群数量及丰度，从中分析不同处理棉田土壤细菌多样性的信息。
对不同连作、轮作处理的棉田土壤细菌的D G G E 分析显示( 图3 ．2 ) ，各处理样品产生1 5 ．2 6 条不等的条带，说明扩增的1 6 Sr D N A的基因片段在D G G E 中得到有效分离各条带的迁移率和强度不同，有些样品具有较明显的区别与其他样品的特异条带，表明各处理的菌群结构、组成、优势菌群及菌群丰度具有较大差异由表3 ．1 可以看出，连作 1 3 a 以上的棉田土样D G G E 条带数由2 4 条减少N 2 2 、1 7 、1 5 条，多样性指数由3 ．0 4 6 4 8 减少为2 ．3 3 6 1 l ，均匀度由0 ．9 5 8 6 减少为0 ．8 6 2 7 结果表明连作形成棉田土壤的栽培环境单一，造成群落结构失衡，随连作年限的增加土壤细菌多样性指数、丰富度、均匀度均逐年下降轮作处理样品中，棉花一番茄和棉花一草木樨条带数最多为2 6 条，多样性指数和丰富度也较高，均匀度指数变化不明显表明轮作番茄和草木樨对连作棉田细菌群落多样性改善的效果较为明显根据D G G E 图谱中每个样品不同条带的强度和迁移率，按照U P G M A 法对每个样品的条带图谱进行细菌群落相似性聚类分析。
分析结果显示( 图3 ．3 ) ，各连作、轮作样品分别聚为两大类，其相似性仅为5 8 ％，说明连作和轮作的菌群结构有显著差异连作> 1 3 a 与6 ．8 a 、9 ．1 2 a 的相似性为7 9 ％，与连作 1 3 a 与6 ．8 a 、9 ．1 2 a 的相似性为7 9 ％，与 1 3 a 的棉田土壤呼吸强度较连作 1 3 a 的棉田与连作 1 3 a 的棉田与连作 1 3 a 与6 ．8 a 、9 ．1 2 a 的相似性为7 9 ％，与< 5 a 的相似性则降低为6 4 ％，形成了特殊的菌群结构轮作连作和轮作的菌群结构有显著差异轮作的种群结构与连作有较大差异，群落多样性增加6 1连作和轮作棉r } | t 壤微生物多样性分析及P C P R 葡抹筛选番茄和草木樨对细菌群落多样性的改善效果更为明显6 ．6 连作使土壤中的一些优势茵群数量发生改变1 种未培养细菌( C X ．1 与u n c u l t u r e ds o i lb a c t e r i u m ( F J l 8 4 3 3 7 ) 序列同源性为9 7 ％) 消失或减弱，2 种未培养细菌( c x ．2 、C X 一3 与u n c u l t u r e db a c t e r i u m ( E F 4 9 012 3 ) 、u n c u l t u r e db a c t e r i u m ( D Q 0 9 5 8 5 3 ) 序列同源性分别为9 3 ．5 ％和9 7 ％) 在连作棉田中得到富集，数量增加，而轮作则使富集菌群密度下降。
同时轮作还使土壤一些非优势的菌群得到加强，增加了一些特征性菌群6 ．7 从分离的棉花根际细菌中筛选出对棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、棉花立枯病菌具有较高拮抗活性的C R B l1 5 菌株盆栽试验结果显示该菌株接种后表现出一定的防病作用，同时还有促进发芽、增加生物量等促生效果形态鉴定结合1 6 Sr D N A 序列分析确定为枯草杆菌该研究结果为探索利用P G P R 菌株修复和改良连作棉田的微生态环境，安全、有效地克服和治理连作障碍提供了科学基础新穗农业大学硕一| ：学位论文参考文献【1 】孙泽昭，黄乐珊．新疆棉花产业优势分析【J 】．甘肃农业，2 0 0 7 ，0 9 - 2 1 - - 2 3 ．【2 】殷永娴．设施栽培下土壤中硝化、硝化作用的研究【J 】．生态学报，1 9 9 6 ，1 6 ( 3 ) ：2 4 6 - - 2 5 0 ．【3 】张淑香，高子勤．连作障碍与根际微生态研究【J 】．应用生态学报，2 0 0 0 ，0 1 ：3 7 —4 0 ．【4 】车玉伶，王慧．微生物群落结构和多样性解析技术研究进展【J 】．生态环境，2 0 0 5 ，1 4 ( 1 ) ：1 2 7—1 3 3 ．【5 】侯永侠，周宝利，吴晓玲．土壤灭菌对辣椒抗连作障碍效果【J 】．生态学杂志，2 0 0 6 ，2 5 ( 0 3 ) ：1 3 —1 5 ．【6 】胡江春，汪思龙，王书锦．森林生态系统中土壤微生物的作用与应用【J 】．应用生态学报，2 0 0 4 ，1 5 ( 1 0 ) ：1 9 4 3 —1 9 4 6 ．【7 】孔庆科，丁爱云．内生细菌作为生防因子的研究进展[ J 】．山东农业大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 1 ，3 2 ( 2 ) ：2 5 6 - - 2 6 0 ．【8 】P i e t e r s eCMJ ．R h i z o b a c t e r i am e d i a t e di n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ：t r i g g e r i n gs i g n a l i n ga n de x p r e s s i o n [ J ] ．P l a n tP a t h o l o g y ，2 0 0 1 ，1 0 7 ：5l 一61 ．【9 】姚怀应，何根立．不同土地利用方式对红壤微生物的影响【J 】．水土保持报，2 0 0 3 ，1 7 ( 2 ) ：5 1 —5 4 ．【1 0 】姜成林，徐丽华．微生物多样性及其保育【J 】．生物多样性，1 9 9 7 ，5 ( 4 ) ：2 7 6 - - 2 8 0 ．【l l 】姚健，杨永华．农用化学品污染对土壤微生物群落D N A 序列多样性影响研究【J 】．生态学报，2 00 0 ，2 0 ：3 8 —4 1 ．【1 2 】韩芳，邵玉琴．黄甫川流域不同土地利用方式下的土壤微生物多样性【J 】．内蒙古大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 3 ，3 4 ( 3 ) ：2 9 8 - - 3 0 3 ．【1 3 】马晓梅．塔里木荒漠河岸林主要建群植物根际微生物分布特点[ D 】．新疆：新疆农业大学林学院，2 0 0 7 ．【1 4 】王秀丽．重金属复合污染对土壤环境微生物群落的影响机理研究【D 】．浙江：浙江大学水土资源与环境研究所，2 0 0 2 ．【1 5 】王勐骋，杨永华，姚健．利用R A P D 分子标记研究农用化学品污染土壤微生物群落的分子多样性【J 】．南京大学学报( 自然科学) ，2 0 0 0 ，3 6 ：5 1 8 - - 5 2 2 ．【1 6 】贾建丽，李广贺，张旭，等．基于P C R - - D G G E 技术的石油污染土壤微生物多态性【J 】．清华大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 5 ，0 9 ：1 2 1 7 一1 2 2 0 ．【1 7 】赵勇，李武，周志华，等．应用P C R - - R F L P 及P C R - - T G G E 技术监测农田土壤微生物短期动态变化【J 】．南京农业大学学报，2 0 0 5 ，2 8 ( 3 ) ：5 3 —5 7 ．【1 8 】孙波，赵其国，张桃标，等．土壤质量与持续环境I Ⅱ、土壤质量评价的生物学指标【J 】．土壤，1 9 9 7 ，2 9 ( 5 ) ：2 2 5 - - 2 3 4 ．连作和轮作捣n 1 十壤微生物多样性分折及P 6 P R 菌株筛选【19 】Z l l e sL ．F a t t ya c i dp a t t e r n so fp h o s p h o l i p i d sa n dl i p o p o l y s a c c h a r i d ei nt h ec h a r a c t e r i z a t i o n so fm i c r o b i a lc o m m u n i t i e si ns o i l s ：ar e v i e w [ J ] ．B i o l o g ys o i l s ，1 9 9 9 ，2 9 ：l l1 —12 9 ．【2 0 】白清云．土壤微生物群落结构的化学估价方法【J 】．农业环境。