电泳技术概论 内蒙古科技大学基础生物实验教学示范中心• 电泳 是指带电粒子在电场中向 与其自身带相反电荷的电极移动 的现象正极负极带负电粒子带正电粒子第一节 基本原理 • 迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位 电场强度下泳动的速度，可用下列公式计 算： •Ｕ =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt • Ｕ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒 泳动速度（cm·s-1）；E为电场强度（ V·cm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l 为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V ）；t为通电时间（s或min）通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率 • 1迁移率单位= 10-5 cm2·V-1·min-1• 在确定的条件下，某物质的迁移率为常 数，是该物质的化学特征常数• 颗粒带净电荷多，直径小而接近于 球形，则在电场中泳动速度快，反 之则泳动速度慢 • 迁移率还与分子的形状，介质粘度 ，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗 表面电荷成正比，与介质粘度及颗 粒半径成反比影响电泳速度的外界 因素• 1.电场强度 • 2 .溶液的pH值 • 3.溶液的离子强度 • 4.电渗现象 • 5.温度的影响 • 6.支持物的影响 影响电泳速度的外界因素 1.电场强度• 电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降，它 对泳动速度起着十分重要的作用。
• 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快影响电泳速度的外界因素2．溶液的pH值 • 溶液的pH值决定了带电颗粒解离的 程度，也决定了物质所带净电荷的 多少影响电泳速度的外界因素 3.溶液的离子强度• 电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降 低，原因是带电的离子会吸引相反符号 的离子聚集在其周围，相成一个与运动 粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方 向运动，从而降低了该粒子的迁移率• 离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数 相关的用离子强度来表示，它的数值 如下式：• 式中s表示共有s种离子，Ci和Zi分别代表 每种离子的浓度（mol/L）和价数 影响电泳速度的外界因素 4.电渗现象• 一个U形管的底部装上一块素烧瓷板（密 封）管中装入液体，并在两端加入电极 通电，就会看到负极的液面上升因为 瓷板带有负电荷，液体相对地带有正电 荷，因而向负极移动这种液体在电场 中对于一个固体支持物的相对移动，称 为电渗现象 影响电泳速度的外界因素 5.温度的影响• 电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对 电泳有很大的影响 • 温度每升高1℃，迁移率约增加2.4%为 降低热效应对电泳的影响，可控制电压 或电流，或在电泳系统中安装冷却散热 装置影响电泳速度的外界因素 6.支持物的影响• 对支持物的要求一般是均匀和吸附 力小，否则电场强度不均匀，影响 区带的分离，实验结果及扫描图谱 无法重复。
第二节 电泳的分 类• 一、按分离原理分类• 二、按有无固体支持物分类 电泳的分类一、按分离原理分类区带电泳移界电泳等速电泳聚焦电泳四种电泳的分类 二、按有无固体支持物分类 第三节 醋酸纤维素薄膜电• 一、原理以醋酸纤维素薄膜为支持物 • 二、材料和试剂 • 三、特点• 特点： • １ 电泳后区带界限清晰； • ２通电时间较短；• ３它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因 此无拖尾现象； • ４灵敏度高，样品用量少 • ５对染料也没有吸附 • ６它的电渗作用虽高但很均一，不影响 样品的分离效果醋酸纤维素膜电泳槽• 可做各种醋酸纤维素膜电泳、纸电泳及 载玻片电泳等 第四节 琼脂（糖）凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳主要用于分离 、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限 制性内切酶图谱制作等，为DNA分 子及其片段分子量测定和DNA分子 构象的分析提供了重要手段 DNA分子大小与琼脂糖浓度的关 系 核酸构型与琼脂糖凝胶电 泳分离的关系 • 共价闭环cccDNA>直线DNA> 开环的双链环状DNA 琼脂糖凝胶电泳的基本操作 • １、配制缓冲液贮备液 • ２、水平型琼脂糖凝胶制备 • ３、样品的制备与点样 • ４、电泳 • ５、染色 • ６、样品回收 桥式水平电泳槽用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及 分子量测定 DNA回收电泳槽 用于电洗脱回收DNA微型水平电泳槽 • 用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备 及分子量测定 第五节 丙烯酰胺凝胶电泳 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯 酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法 • PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核 酸等生物分子的分离、定性、定量及少 量的制备，还可测定分子量、等电点等 丙烯酰 胺凝胶有以下优点： • ①几乎无电渗作用。
• ②化学性能稳定，与被分离物不起化学 反应对pH和温度变化较稳定 • ③在一定浓度范围内凝胶无色透明，有 弹性，机械性能好，易观察 • ④凝胶孔径可调 • ⑤分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶 电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为 一体，因而有更高的分辨率一、丙烯酰胺凝胶聚合原 理 催化剂和加速剂的种类 • （1）AP-TEMED：化学聚合作用加速剂TEMED的碱基可使催化剂过硫酸铵（简 称AP）的水溶液产生出游离氧原子，然后激活 Acr单体，形成单体长链，在交联剂Bis作用下 聚合成凝胶 • （2）核黄素-TEMED：光聚合作用光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生， 因为核黄素在TEMED及光照条件下，还原成 无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从 而引发聚合作用 二、凝胶组成成分的化学、物理 性质丙烯酰胺会产生如下几个化学反应： • 高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸 和NH3 • 与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应， 生成β-芳氧基或烷氧基丙酰胺 • 在20℃能NH3反应，生成β、β′、β″-氮川 三丙酰胺 • 与一些硫醇反应，生成β-烷基丙酰胺 • 也会由于超声、γ-射线和自然光线引起 聚合作用。
如果烃键靠近在高度聚合的 位置，酰胺基也会受到分子间的缩聚作 用而成亚胺桥三、凝胶的孔径可调性及其他性 质 • 每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂 的总克数称凝胶浓度，用T%表达；T% = (a+b)/m • a：丙烯酰胺克数；b：N,N-甲叉双丙烯 酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升） • 凝胶溶液中交联剂占单体和交联体 总量的百分数称为交联度，常用C% 表示C% = b/（a+b） • 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性 ；交联度过低，凝胶呈糊状 • 分子筛效应 • 标准凝胶 四、丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳的应应用 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效 应，可分为连续的和不连续的两类 • 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH 值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在 电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀 的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提 高分辨能力 • 在不连续PAGE系统里，存在三种物 理效应,，即电荷效应、分子筛效应 和浓缩效应• １、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动 • ２、分子筛效应：区别不同大小分子种 类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小 的能力即分子筛效应。
这种效应与凝胶过 滤过程中的情况不同 ３、浓缩效应五、聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常 现象及解决办法 • １、凝胶未聚合 • ２、未加水层时凝胶聚合 • ３、电泳后未能检测出样品 • ４、样品分离区带宽或拖尾 • ５、只显一条区带 • ６、分离区带呈条纹状 第六节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE) • 原理概述 早在1964年，Ferguson为了描述蛋白质在 淀粉凝胶中的电泳行为曾提出下列公式 ： 1gmR= -KRC +1gm0后来证明该公式同样适用于聚丙烯酰胺 凝胶电泳式中，mR是蛋白质在凝胶浓 度为C时的相对迁移率； 双垂直电泳槽• 可用各种凝胶电泳，可同时做两块板 电泳印迹• 电泳转移即电泳印迹它 是利用低电压，大电流的 直流电场使凝胶电泳的分 离区带或电泳斑点转移到 特定的膜上 电泳技术在农业中的应用• 农业科研研究的对象是动物、植物和微生物 农业生产的产品也是动物、植物和微生物 产品在自然界中它们的种类有千千万万， 它们的生殖和死亡、生长和发育、遗传和变 异，以及新陈代谢的全部生命过程也是不同 的从DNA分子转如成RNA分子，由RNA 分子再转译成多肽链，经过进一步切除、修 饰、加工处理，卷曲构成蛋白质亚基。
这些 DNA、RNA和蛋白质分子不仅分子量不同， 而且有不同的电荷效应，就可以通过电泳方 法进行分离和研究 电泳技术在农业科研中的应用 • 1、 动植物分类及其种质资源研究 • 2、 基因分析 • 3、 遗传育种 • 4、 杂种优势理论 • 5、 雄性不育机制 • 6、器官组织分化与生长发育中的基因调 控电泳技术在农业生产中的应用• 1、 种子纯度检验• ２、农产品贮藏和加工的质量检验 等 电 聚 焦 示 意 图电泳槽• 适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上 • DF-9夹芯电泳槽 • 可做各种凝胶电泳•DF-13A转移电泳槽 转 移 电 泳 槽单垂直电泳槽可做各种凝胶电泳 双垂直电泳槽• 可用各种凝胶电泳，可同时做两块板 新微型水平电泳槽 • 用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备 及分子量测定 板 式 序 列 宽 槽• 用于DNA序列分析 DNA回收电泳槽 用于电洗脱回收DNA序 列 分 析 槽• 用于DNA序列分析• 带冷却，温度可测 等电聚焦电泳槽• 可做等电聚焦电泳及各种水平电泳 • 用于蛋白质、多肽、核酸、同功酶分析 及鉴定 圆盘电泳槽可做圆盘管式凝胶电泳桥式水平电泳槽用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及 分子量测定 DF-C型定时双稳电泳仪稳压：0-150-600V； 稳流：0-25-100mA，定时：0-99h 过载保护，两对输出插孔DF-D型双稳电泳仪 高亮度数字表，电压、电流分别显示 过载保护，两对输出孔，可做一般电泳 高压双稳电泳仪 • 0-400-1600V • 稳流：0-25-100mA，连续可调 • 可做序列分析电泳和一般电泳高压三恒电泳仪 • 恒压：0-3000V；恒流：0-200mA； • 恒功率：0-60W• 可做聚焦、序列分析多种电泳转移电 泳仪 • 自动优先恒定控制：恒 压及恒流，无需换档， 操作简单 • 同时显示电压、电流设 定值（或输出值） • 具有设定参数与输出值 显示自动切换功能 • 具有高压输出启动确认 及停电自动关断保护 • 最大输出： 200V/1500mA/200W毛细管电泳仪凝胶真空干胶器 • 用于电泳后凝胶的干燥 • 干燥时间：20-40min 凝胶成像分析系统 • 用于对各种凝胶和放射自显影胶片、印 记杂交片的分析 。