本文格式为Word版，下载可任意编辑酵母双杂交操作步骤(中文翻译) （酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是俭约质粒DNA 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中优点：比次序转化更轻易操作 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四 缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （添置来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （添置来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （添置来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu DO supplement 0.69g ; （添置来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （添置来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 留神：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的买来就加进去了的）假设不含硫酸铵，那么要在终浓度%的YNB中再参与%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中参与总量为的YNB与硫酸铵 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液参与过滤即可使用） 2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至（大约加10M NaOH 200ul 即可），之后补水至950 ml 3.高压完后待温度降至55℃以下，参与50 ml40%葡萄糖 YPD培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 20 g/L 琼脂（只有制作平板才用） 20 g/L 葡萄糖 (即2%) 1x YPDA培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 0.03 g/L 腺嘌呤（即终浓度为％）腺嘌呤可以耐受高温 20 g/L 葡萄糖 (即2%) 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液参与。
李博士阅历这一步不高压，过滤即可使用）2.配制%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml 腺嘌呤溶液参与或将腺嘌呤直接加进去，为了便当我将直接加进去一起高压） 3.（蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至，加水至935ml， 121℃高压15min 留神： 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可 可以在YPDA中参与20 g/L的琼脂，以配成平板 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/Lkanamycin可以20℃贮存一个月，参与到平板中去可以4℃贮存一个月 PEG/LiAc溶液（即配即用） 用以下贮存液来配制 50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶 10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶 10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶 结果配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例） 终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要参与的物质 PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG TE buffer 1X 1 ml of 10X TE LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc 无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释） 10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH (高压) 10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调理PH至高压 For β-galactosidase 滤膜测验 Z buffer溶液： Na2HPO4? 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4? 14H2O 那么 20.739 g/L）NaH2PO4? H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4? 2H2O 那么 6. 21g/L） KCl 0.75 g/L MgSO4? 7H2O 0.246 g/L 结果调PH至，高压，室温下可以贮存1年 X-gal 溶液： X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存 Z buffer/X-gal 溶液： 100 ml Z buffer ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇） ml X-gal 贮存液 ONPG 溶液：（即配即用） ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至. 留神： 1.ONPG需要1～2h才能溶解 2.每次用之前崭新制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer 将 mlβ-巯基乙醇参与100 ml Z buffer中即可 为了转化告成的小提示： 1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基假设菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种也要大力涡旋使细胞团分散开来 2.假设过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前确定要充分涡旋使培养基 3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞 4.为了提高转化效率，要在1小时内打定酵母感受态细胞假设有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低 5.当举行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量务必过度，而AD质粒的量要缺乏一般BD是AD的两倍李博士：此要求一般是针对文库筛选而言） 6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到全体液体被吸收可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的分散，摇动的时候shake the plate back and forth —not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳） 一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。
接种的时候采取四区分区画线法） 二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤： 1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中 2.强烈振荡或涡旋5min，使全体团块分散开来 3.转移酵母液到50 mlYPD（固体——也有液态的，未参与琼脂粉耳）或者SD培养基中 4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600> 5.转移片面过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（固体）中，使最终OD600在～之间 6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为～. （If the OD600 is < , something is wrong with the culture） 7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min 8.弃去上清，参与25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母 9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min 10.轻轻倒出（弃去）上清 11.将细胞重悬于崭新打定的，无菌的1xTE/1xLiAc（在测验开头之前置备） (至此酵母感受态细胞制备完毕) 12. 向无菌的微量离心管中参与质粒DNA各和鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
13.再向每管中参与 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀 14.向每一管参与600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀 15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min 16.向每一管参与70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡 17.42℃水浴热激15 min 18.取出后在冰上冷却1-2 min rpm室温离心5 min，弃去上清 20.用 ml 无菌的1×TE重悬酵母 21.取适合体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，结果1/3涂在SD/–Leu/–Trp上科内仅涂布二缺与四缺板） （在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）由于在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD 已经转进去了假设在四缺板中能生长，说明诱饵和文库断定有作用，接着做一个α- gal 测验假设是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了假设酵母能生长的 话就接着做一个β- gal。
所以有的人同时转化两种菌种这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了 之后计算转化率，假设转化率达成10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验测验 三. α和β-gal测验：（我就做β-gal试验，要留神假设做β-gal的话， 这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页） 1.试剂： 2.原理： 。