显微镜的基本光学原理（一） 折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角二） 透镜的性能 透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类 当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称"焦点"，通过交点并垂直光轴的平面，称"焦平面"焦点有两个，在物方空间的焦点，称"物方焦点"，该处的焦平面，称"物方焦平面"；反之，在象方空间的焦点，称"象方焦点"，该处的焦平面，称"象方焦平面" 光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能三） 凸透镜的五种成象规律1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。
光学显微镜的成象（几何成象）原理 只有当物体对人眼的张角不小于某一值时，肉眼才能区别其各个细部，该量称为目视分辨率ε在最佳条件下，即物体的照度为50~70lx及其对比度较大时，可达到1'为易于观测，一般将该量加大到2'，并取此为平均目镜分辨率 物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的距离有关有公式y=Lε距离L不能取得很小，因为眼睛的调节能力有一定限度，尤其是眼睛在接近调节能力的极限范围工作时，会使视力极度疲劳对于标准(正视)而言，最佳的视距规定为250mm(明视距离)这意味着，在没有仪器的条件下，目视分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地区分大小为0.15mm的物体细节 在观测视角小于1'的物体时，必须使用放大仪器放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的一） 放大镜的成像原理 表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光路图如图1所示位于物方焦点F以内的物AB，其大小为y，它被放大镜成一大小为y'的虚像A'B'放大镜的放大率Γ=250/f'式中250--明视距离，单位为mmf'--放大镜焦距，单位为mm该放大率是指在250mm的距离内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。
二） 显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已 图2是物体被显微镜成像的原理图图中为方便计，把物镜L1和目镜L2均以单块透镜表示物体AB位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B' A'B'位于目镜的物方焦点F2上，或者在很靠近F2的位置上再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察虚像A''B''的位置取决于F2和A'B'之间的距离，可以在无限远处（当A'B'位于F2上时），也可以在观察者的明视距离处（当A'B'在图中焦点F2之右边时）目镜的作用与放大镜一样所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像 （三） 显微镜的重要光学技术参数 在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。
这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准1． 数值孔径 数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积用公式表示如下：NA=nsinu/2 孔径角又称"镜口角"，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比 显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1 数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4 这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小OLYMPUS现在推出了世界最先进的物镜设计理念与最先进的精密加工技术,使50倍物镜的数值孔径在0.8的情况下工作距离达到1毫米,100倍物镜的数值孔径在0.9的情况下工作距离达到1毫米,这几乎是一个接近于理论的数值.2． 分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称"鉴别率"其计算公式是σ=λ/NA式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施（1） 降低波长λ值，使用短波长光源2） 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）3） 增大孔径角u值以提高NA值4） 增加明暗反差3． 放大率和有效放大率 由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积：Γ=βΓ1 显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。
放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率 分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念有关系式：500NA<Γ<1000NA 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配 4． 焦深 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：（1） 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比2） 焦深大，分辨率降低 由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难在显微照相时将详细介绍5． 视场直径（Field Of View） 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。
视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围视场直径愈大，愈便于观察有公式 F=FN/β式中F: 视场直径，FN：视场数（Field Number, 简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧），β:物镜放大率由公式可看出：（1） 视场直径与视场数成正比2） 增大物镜的倍数，则视场直径减小因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份目前显微镜最大视场数是OLYMPUS的26.56． 覆盖差 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量 国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度 7． 工作距离WD 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。
在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小物镜 物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准 物镜的结构复杂，制作精密，由于对象差的校正，金属的物镜筒内由相隔一定距离并被固定的透镜组组合而成物镜有许多具体的要求，如合轴,齐焦 齐焦既是在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图象清晰后，在转换另一倍率的物镜时，其成象亦应基本清晰，而且象的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜 质量的一个重要标志，它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关 现代显微物镜已达到高度完善，其数值孔径已接近极限，视场中心的分辨率与理论值之区别已微乎其微但继续增大显微物镜视场与提高视场边缘成象质量的可能性仍然存在，这种研究工作，至今仍在进行 显微物镜与目镜在参于成象这点上是有区别的物镜是显微镜最复杂和最重要的部分，在宽光束中工作(孔径大)，但这些光束与光轴的倾角较小(视场小)；目镜在窄光束中工作，但其倾角大（视场大）当计算物镜与目镜，在消除象差上有很大差别。
与宽光束有关的象差是球差、慧差以及位置色差；与视场有关的象差是象散、场曲、畸变以及倍率包差 显微物镜是一消球差系统这意味着：就轴上的一对共轭点而言，消除了球差并且实现了正弦条件时，每一物镜仅有两个这种消球差点因此，物体与象的计算位置的任何改变均导致象差变大1． 物镜的主要参数（1） 放大率β（2） 数值孔径NA（3） 机械筒长L：在显微镜中，物镜支承面到目镜支承面之间的距离称为机械筒长对于一台显微镜来说，机械筒长是固定的我国规定机械筒长是160毫米4） 盖玻片厚度d（5） 工作距离WD这些参数，大多刻在物镜筒上，如图3所示有一种所谓筒长无限的显微物镜，这种物镜的后方一般带有辅助物镜（也叫补偿物镜或镜筒物镜），被观察物体位于物镜前焦点上，经过物镜以后，成像在无限远，再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上，如图4所示在物镜和辅助物镜之间是平行光。