应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量关键词：Picogreen荧光染料DNA 定量 DNA精确定量点击：1380作者：原平皓生物简介：对微量的双链DNA进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要，例如cDNA 文库的构建；用于亚克隆的DNA片段的纯化；定量DNA扩增产物，在药物中DNA 分子残留的测定等检测核酸浓度最常用的方法就是检测核酸在260nm （ A260 ） 处的光吸收，这一方法主要的缺点是单链核苷酸和单核苷酸会产生干扰信号，核 酸样品中的杂质也会影响结果光吸收不能区分DNA和RNA,灵敏度也相对较 低（用1cm的比色杯在A260值为0.1时相对应的双链DNA浓度为5 口 g/ml ）Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料:其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA； 检测范围宽，可跨越4个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并 且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰目前使用 Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测，并被2010年版《中华 人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法原理：DNA样品V等比例浣合避光孵WSmin便用荧光计曲亍翻检测方法:2. 所需器材ModulusTM单管型多功能检测仪（9200-003）微量适配器（9200-928）微量比色皿PicoGreen 试剂3. 试验方案3.1试剂准备PicoGreen是以1 mL的浓缩液形式保存在无水的DMSO （二甲基亚砜）中。
实验 当天，配制2 X PicoGreen试剂的工作溶液，用1XTE按1:200的比例稀释 浓缩液(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH7.5)如果要准备足够的工作溶液测 定20个样品，可在20mL1x TE中加入100 口 L PicoGreen dsDNA定量试剂由 于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制PicoGreen试剂见光易降 解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果3.2 DNA标准曲线3.2.1标准品工作液的配制：Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉(货号：D4522-1MG) 1mg (Tris，Nacl等浓度已成标准体系)，加入1 mL双蒸水，配制成1 mg/ mL的 标准品工作液；3.2.2标准品工作液稀释：(1) 母液稀释：取10ul (1mg / mL)标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓 度稀释成10ug/mL，取10ul(10ug/mL)标准品工作液加入到990ul TE溶液中， 浓度稀释成100ng/ mL；(2) 倍比稀释：取800ul (100ng/mL)的标准品工作液加入到200ul TE溶液中，浓度达到80ng / mL (药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL 范围线性较好，该法DNA检出限为0.3ng/ml)，取500ul (80ng/mL)的标准 品工作液加入到500ul TE溶液中，浓度稀释到40ng / mL；依次倍比稀释，配成 20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml 的标准品溶 液；2XDNA溶液浓摩2XDXA溶液的体頑(mL)2 X PieoGre^ 涪浪的体积PicoGi^rj试剂测立中 DNA豹终底度(nsqiiL)800.50.540400.50.52D200.50.510100.50.5530.50.52.52.5050.51.251.250.50.5D.6250.6250.5O.312S00.50.5空白3.2.3标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取 100ul混匀，避光室温放置5min。
3.2.4使用ModulusTM单管型多功能检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值: 将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检 测皿的外部，可以驱散气泡以1XTE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的 荧光值；用标准品溶液的浓度(ng/ml)对应的荧光强度作直线回归，制备标准 曲线标准曲线图浓度(ng/ml)4样品分析在每个样品中加入等体积的2XPicoGreen工作溶液（3.1节准备），充分混匀， 避光于室温下孵育5分钟将孵育好的溶液加入微量比色皿，使用ModulusTM 单管型多功能检测仪检测其荧光值将样品溶液的荧光强度代入回归方程，求出 样品的残余DNA含量（ng/ml）。