核酸杂交技术(SouthernBlot、NorthernBlot)（一）SouthernBlot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…§§（一）SouthernBlot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩增重排等DNA—脂糖电泳—印迹转移一^预杂交—k杂交〔变性探针）一洗膜一放射自显影或显色GtlclectixaphDrKisi>NA(JcAVt-wiEhn^Lru.[locinac>FilttTr=nDNAfnl^mentsHybridizewithlibeled吓AorKNA卩卩应DNAofiiktcmlcwdsY||ii||Alkjline^HulLjnllliritiliK：fmm円1toAlter（二）NorthernBlot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量mRNAffi取一甲醛变性电泳一印迹转移一预杂交杂交〔变性探针）一枕膜一放射自显影或化学发光（三）探针标记技术1标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northernblot简介Northernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况Northernblot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段Northernbl这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程Northernblot在1977年由斯坦福大学JamesAlwine，DavidKemp和GeorgeStark发明Northernblotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southernblot（依据生物学家EdwinSouthern名字来命名）来命名，Southernblot主要用来对DNA进行分析流程首先需要从组织或细胞中提取总RNA，或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。
然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RNA降解RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达Northernblot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过的无表达的基因材料电泳胶Northernblot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛可以减少RNA的二级结构，电泳完成后的胶可经过EB染色后在紫外下检测RNA的质量而对小分子的RNA或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺变性胶电泳RNA电泳中可以依据核糖体RNA的大小大致判断条带的大小，28SRNA大小一般为5kp，18SRNA大小一般为2k28SRNA的亮度一般是18S的两倍探针Northerblot中探针的序列需要和检测目的基因序列互补配对，探针可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的长度必须大于25bp，体外合成的RNA探针可以采用更高的退火温度来减少背景中的噪音。
探针一般采用P或者地高辛来进行标记杂交过后，可采用X胶片显色的方法来检测信号应用Northernblot可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式如northernblot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northernblot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列优缺点分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除northernblot外还有RT-PCR、基因芯片、RNA酶保护实验等基因芯片常和northernblot一起使用，但通常情况下，northernblot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化与定量PCR的高灵敏度相比，northernblot显然要逊色不少，但northernblot较高的特异性可以有效的减少实验结果的假阳性Northernblot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以northernblot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。
同时，northerblot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害Northernblot的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用Northernblot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)含有乙二醛一DMS0的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H+梯度尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率(Miller,1987),但用含朋乙二醛一DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利1) 在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛5.4》lDMSO16.0》l0.1mol/L磷酸(pH7.0)3.0》lRNA(多达10》l)5.4》l市售乙二醛通常为40%溶液(6mol/L)由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂(Bio-RadAG501-X8对乙三醛溶液进行去离子处理,直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于一20°C。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃0.1mol/L磷酸钠(pH7.0)的配法如下：将3.9ml1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml1mol/L磷酸氢二钠和90ml水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌每一泳道至多可分析10》gRNA,通常用10-20》g细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上)，如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0》gpoly(A)+RNA2) 将微量离心管盖严，将RNA溶液置于%0C温育50C温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底3) 于50C温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4%琼脂糖分析1kb以下的RNA样品，而用1%琼脂糖分析1kb以上的RNA样品用0mmol/L磷酸钠(pH7.0)后，降温至70C，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L(使RNA酶失活)，再降温至50C，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。
因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭4) 将RNA样品冷却至0C,加入4》l灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛一DMSO凝胶中样缓冲液,随后立即将上述样品加至凝胶加样孔用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28SrRNA或或9S兔0—珠蛋白mRNA,上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道乙二醛一DMSO凝胶加样缓冲液50%甘油10mmol/L磷酸钠（pH7.0）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF5）将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3—4V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度内（pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液6）电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5仇g/ml，用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。
在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小7）RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛如果琼脂糖中浓度大于1%或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡3）用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher&SchuellBA85或与之相当的产品）滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温4）将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因。