1小鼠同种异基因骨髓移植 aGVHD 动物模 型的建立【摘要】 目的 ：建立一个稳定可靠的异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation， Allo-BMT)急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)动物模型，为 Allo-BMT 中 aGVHD 研究提供理想的实验平台方法：以雄性 C57BL/6(H-2b)为供鼠，雌性 BALB/C(H-2d)为受鼠，受鼠致死性全身照射(total body irradiation，TBI)(8.0 Gy)预处理后，在移植物中混合不同比例的供鼠骨髓细胞和脾细胞以引起不同程度的 aGVHD根据存活期、外周血白细胞计数、临床表现及病理检查等判断 aGVHD 程度结果：单纯异基因骨髓组只有部分小鼠出现 aGVHD，75%的小鼠长期存活(30 d)混合不同比例的供鼠骨髓细胞和脾细胞的 Allo-BMT 小鼠出现 aGVHD 的时间和程度均有差异，其中骨髓与脾细胞 1.5:1 或 1:1 混合组小鼠，均可在相对集中的时间内(8～15 d)观察到典型的aGVHD 临床和病理改变。
结论 ：建立 Allo-BMT aGVHD 模型需要加入一定比例的脾细胞，供鼠骨髓与脾细胞 1.5:1 或 1:1 混合进行的 Allo-BMT，可作为理想的aGVHD 动物模型 【关键词】 小鼠;异基因骨髓移植;急性移植物抗宿主病;动物模型Abstract: Objective: To establish a mouse model of acute graft-versus-host disease (aGVHD) after allogeneic bone marrow transplantation (Allo-BMT) for providing experimental studies of aGVHD. Methods：Male C57BL/6(H-2b)mice were used as donors and female BALB/C(H-2d)mice as recipients.All BALB/C(H-2d) mice were randomly divided into 7 groups and received total body irradiation (TBI) 8.0Gy at 4～6 hours prior to transplantation.Bone marrow cells mixed with spleen cells of donors based upon different proportions were injected into the tail vein.Their survival time，leucocyte counts of peripheral blood，clinical and pathologic manifestations of aGVHD were evaluated.Results：Several mice in the group infused with only bone marrow cells showed insignificant aGVHD evidence，75% mice survived for a long 2period (30 d). There were significant differences in the incidence and severity of aGVHD with different ratios of bone marrow cells and spleen cells. The groups with co-transplantation of bone marrow cells and spleen cells in ratio of 1.5:1 or 1:1 showed typical clinical and pathological manifestations of aGVHD at a relatively concentrated time(8～15 d).Conclusion ：To establish a mice model of aGVHD needs additional donor’s spleen cells. Infusion of bone marrow cells and spleen cells in ratio of 1.5:1 or 1:1 is perfect as to establish aGVHD mouse model after allogeneic bone marrow transplantation.Key words: mice;allogeneic bone marrow transplantation;acute graft-versus-host disease; animal model迄今为止，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)仍是影响异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation， Allo-BMT)预后的主要因素之一。
本研究用近交系 C57BL/6 和 BALB/C 小鼠进行同/异基因移植，观察单纯输注骨髓细胞能否引起明显的急性移植物抗宿主病(acute graftversus-host disease， aGVHD)，骨髓细胞和脾细胞联合输注是否为建立模型所必需，同时探讨不同比例的骨髓细胞与脾细胞对诱发 aGVHD 的影响，以建立一个稳定的 Allo-BMT aGVHD 动物模型，为 aGVHD 的研究提供技术平台1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物：SPF 级雄性 C57BL/6(H-2b)为供鼠，雌性 BALB/C(H-2d)为受鼠或供鼠(同基因移植组)，均为 6～8 周龄，体重为 18～22 g实验动物均购于上海中科院，许可证号：SCXK(沪)2003-00031.1.2 主要试剂及仪器：RPMI 1640 培养基(Gibco 公司，美国)，直线加速器(VARIAN CL2300C/D，美国)1.2 方法31.2.1 受鼠的术前准备及饲养条件：受鼠饲养于温州医学院实验动物中心 SPF级实验室，饲养温度 25 ℃，相对湿度 70%，昼夜照明 12/12 h饲料及饮水经灭菌处理，移植受鼠前 5 d 开始饮用含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的无菌水，并持续至移植后 3 周，进行肠道净化。
1.2.2 供鼠骨髓细胞及脾细胞制备：采用颈椎脱位法将供鼠处死，75%乙醇浸泡消毒 5 min 后，在超净台内无菌切取股骨、胫骨及脾脏，剪开股骨、胫骨两端骨骺，用注射器吸取 RPMI 1640 液反复冲洗髓腔，200 目金属网过滤制备单细胞悬液，离心后去上清，裂解红细胞后用不含血清的 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次，细胞计数并调成所需细胞浓度备用(1×108/mL)，台盼蓝染色活细胞数95%脾脏剪成小块后在 200 目金属网上用注射器针芯轻轻研磨，同时用 RPMI 1640 液冲洗过滤成单细胞悬液，离心后去上清液，裂解红细胞，用不含血清的 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次，细胞计数并调成所需细胞浓度备用(1×108/mL)，台盼蓝染色活细胞数95%1.2.3 受鼠的分组及移植过程：实验动物按移植物不同随机分为 7 组，每组 8只(见表 1)移植当日将受鼠装入自制无菌包装的有孔塑料盒内，接受直线加速器全身照射(total body irradiation， TBI)，剂量：8.0 Gy，照射距离：50 cm，照射时间：8 min，剂量率：1.0 Gy/minTBI 后 4～6 h 内经尾静脉注入移植物(骨髓细胞按受鼠体重 2×108/kg 的标准输注)。
移植物根据分组按不同的细胞数混合，每只受鼠输入细胞体积≤0.5 mL1.3 移植物抗宿主病的监测指标及判定标准1.3.1 观察指标观察小鼠的生存期，计算生存率;观察各移植组有无腹泻、体4重下降、弓背、活动度下降及皮肤脱毛溃疡等临床表现，并予以临床 aGVHD 评分[1]定期球后静脉取血计数各组外周血白细胞;病理检查：取濒死小鼠的皮肤、小肠及肝组织作病理切片 HE 染色，光镜下观察按 Thomas GVHD 病理组织学分级标准[2]判定1.3.2 判断标准移植失败：照射后很快死亡，死亡时外周血白细胞计数0.5×109/LaGVHD 发生：外周血白细胞计数0.5×109/L;并有倦怠、精神萎靡、嗜睡、纳差、体重减轻、弓背、脱毛及竖毛、腹泻等症状;病理检查可见肝、肠、皮肤等组织淋巴细胞浸润，正常组织结构破坏，伴有局灶性出血等改变移植后感染：外周血白细胞0.5×109/L，外周血见中性粒细胞核左移，胞浆中有中毒颗粒造血衰竭：死亡时外周血白细胞0.5×109/L造血重建：状态好，体重增加，外周血白细胞0.5×109/L长期生存：造血免疫重建，生存期30 d，体重、饮食、活动均正常1.4 统计学处理方法 多组计量数据比较先进行正态性及多个方差齐性检验，满足条件的采用方差分析，如有差别用 LSD-t 法再行两两比较。
检验水准a=0.05(双侧)，用 Kaplan-Meier 法绘制各组大鼠生存曲线2 结果2.1 观察比较各组小鼠的一般情况及生存期 A 组小鼠于照射后体重进行性下降，伴活动减少，皱毛、弓背，但无腹泻照射后第 6 天开始有小鼠死亡，第 11 天全部死亡，中位生存时间为 8.5 d，与各移植组相比差异有显著性(P0.05)死亡原因均为造血衰竭，死亡时外周血白细胞均0.5×109/L，病死率达 100%B 组5小鼠存活时间均30 d，为长期存活第 1 周内体重变化趋势与 A 组相类似，第 7 天起体重逐渐增加，至第 3 周体重恢复正常并继续增加移植后第 20 天左右外周血白细胞恢复至正常水平C 组小鼠开始症状同 A 组，第 11 天左右小鼠精神、活动逐渐恢复在移植后第 2 周，出现体重下降、弓背体位、活动度差，竖毛等轻微的 aGVHD 表现6 只(占 75%)小鼠生存时间30 dD～G 组为异基因骨髓细胞和脾细胞混合移植组，均于 30 d 观察期内死亡，中位生存期分别为 30 d、19.5 d、17 d 及 8 dD～F 死亡前均有不同程度的腹泻、体重下降、弓背、翘毛、活动度下降、皮肤脱毛等 aGVHD 的临床表现。
其中 D 组小鼠生存时间差异较大，存活期为移植后 9～60 d，出现 aGVHD 的时间也较不一致，与 E、F 两组相比差异有显著性(P0.05)G 组小鼠在移植后 10 d 内全部死亡，临床未观察到典型的aGVHD 表现生存曲线见图 1，移植后小鼠体重变化见图 22.2 各组外周血白细胞计数的监测 A 组小鼠第 6 天外周血白细胞数为(0.20±0.03)×109/L，与移植组(B、C、D、E、F 组)小鼠白细胞[(1.05±0.34)×109/L、(1.45±0.52)×109/L、(1.35±0.57)×109/L、(1.35±0.57)×109/L、(1.35±0.57)×109/L)]比较差异有显著性(P0.05)，而 B、C、D、E、F 组第 6 天白细胞数差异无显著性(P0.05)，此后 A 组小鼠白细胞数持续下降，于 11 d 内全部死于造血衰竭B、C、D、E、F 组照射后 1 周内，外周血白细胞较移植前明显下降，移植后第 15 天，外周血白细胞亦差异无显著性(P0.05)C、E 组 3 周后显著回升，B、C、D、E、F 组 20 d 后恢复正常G 组小鼠均于移植后 10 d 内死亡，死亡时。