遗传与优生学实验指导书目 录实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备………… 3实验二 人类染色体的形态观察与非显带核型分析…………… 9实验三 X染色质的标本制备…………………………………… 15实验四 遗传咨询…………………………………………………17实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【目的要求】1.初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法2.初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法实验原理】 、人体外周血淋巴细胞培养(人体末稍血、微量全血短期培养)及其染色体标本制备是国内外研究显示染色体最常用和效果最好的方法此方法取材方便,用血量少，操作简便，现已广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等人体外周血中的小淋巴细胞，是已分化、处于G0期的细胞，几乎不具有分裂增殖能力，在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞因此，需采用刺激细胞增殖的措施人们发现从芸豆(菜豆)中提取的植物血球凝集素(植物血凝素PHA)可以刺激小淋巴细胞进行有丝分裂，即在PHA作用下，处在G0期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞淋巴母细胞具有分裂能力，重新进入增殖周期进行有丝分裂。
在PHA作用下体外培养72小时左右，多数淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期，此时，胞分裂相较多，但都处于分裂的不同时期一般,制作染色体标本,主要是显示细胞分裂中期染色体，因中期染色体形态最为典型、最为清晰，最易辨认，是研究染色体的最好阶段为了获得大量可供分折的中期染色体，需在终止细胞培养前数小时加人适当浓度的有丝分裂阻断剂——秋水仙素(或其衍生物秋水仙胺)它可特异地抑制纺锤丝的形成、阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期借此可获得大量中期分裂相细胞在进行染色体标本制备的过程中，首先要进行低渗处理，使细胞体积胀大、染色体松散开而便于观察分析最常用的低渗液为0.075mo1/L的KCl,也可用水或1%枸橼酸钠等低渗后的细胞需用固定液固定醋酸固定液具有膨胀、固定作用它和醇类混合固定,有利于染色体松散,可获得分散好、易于分析的分裂中期染色体标本现在常用的固定液为甲醇一冰醋酸（3：1)固定液实验准备】1.试剂RPMI-1640营养液，小牛血清，0.25胰蛋白酶，Hanks液，双抗（青霉素、链霉素），2%碘酒，0.75%酒精,3.8%NaHCO3另备520U/ml肝素,40ug/ml秋水仙碱,PHA，O.075mol/L低渗液，甲醇，冰醋酸，Giemsa染液，二甲苯和香柏油。
2.器材超净工作台,光学显微镜(附照相设各),隔水式恒温培养箱,离心机,冰箱,高压蒸汽消毒锅,鼓风干燥箱,无菌正压滤器,分析天平(感量1/10毫克).架盘天平,链霉素培养瓶及瓶塞,肝素小瓶及瓶塞(取血用),10ml吸管,直头小吸管,5ml刻度离心管,2ml或5ml一次性注射器,量筒,烧杯,搪瓷盆,搪瓷盘,试管架.叶盘,片盒,止血带,棉签,大吸球,小吸头,pH试纸,废液盘、缸,解剖剪子,镊子,记号笔，4℃ 预冷的载玻片,酒精灯,火柴,染色缸或染色玻璃板,擦镜纸等实验材料】人静脉血【实验步骤及方法】一、取血在取血前，按照附录一、二进行各种用品的清洗、无菌处理,配制、分装并冻存培养液(5ml/瓶)及肝素(0.1ml肝素/瓶,浓度为520U/ml)供取血用常规消毒肘部皮肤及肝素小瓶，2ml注射器抽取静脉血1~1.5ml,直接接种于肝素小瓶，轻轻摇匀，待接种培养二、接种培养将事先配制冻存的装有5ml培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出,置室温融化，碘酒、酒精消毒瓶塞，用2ml注射器将肝素小瓶中静脉血取出接种到培养瓶中，每瓶约0.2~0.4ml,轻轻摇匀,置37℃培养箱培养72小时三、积累分裂中期细胞在血培养70小时时(即收获细胞前2小时)，各培养瓶内加人浓度为40ug/ml秋水仙素2滴，终浓度为0.1~0.15ug/ml，摇匀，置37℃温箱继续培养2小时后收集细胞、制片。
四、制片1.收集细胞:从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移人5ml刻度离心管内，以2000r/min离心10分钟,吸去上清液，保留底物2.低渗:每管加入37℃预温的0.075mol/L KC1溶液5ml，用吸管轻轻吹打均匀，置37℃温箱低渗20～25分钟，以达到红细胞破坏、淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的3.预固定:低渗处理后，每管加人2~3滴甲醇:冰醋酸(3:1)固定液，将细胞轻轻吹打均匀，置离心机2O0Or/min离心10分钟4.固定(一):去上清液，加固定液5ml，吹打均匀，2000r/min离心10分钟5.固定(二):去上清液,再加人5ml固定液,吹打均匀,2000r/min离心10分钟6,滴片:去上清液，留底物，每管加人少许(0.2~0.3ml)固定液(加入量视底物量而定)，将底物吹打均匀，制成细胞悬液，然后用吸管吸取混匀的细胞悬液，约以20cm或更高的距离滴至预冷的载玻片上，每片约2~3滴，随即将玻片在酒精灯火焰上微烤(一过性微烤数次)，以助细胞、染色体分散，使之均匀平铺于玻片上，将制片放人片盘，空气干燥后，收集于片盒中7.染色和观察:待制片晾干后,放人约l:10Giemsa染液的染色缸中染色15分钟左右,或架在染色用玻璃板上扣染15分钟左右(扣染是指染色时,将染色体制片的细胞面朝下,架在玻璃板上,将染液滴人玻璃板和细胞面之间),自来水轻轻冲洗,晾干后光镜下观察。
先用低倍镜观察后,选择分散好的染色体换为高倍及油镜观察,注意人类核型中近端、亚中和中着丝粒染色体的形态特点(图Ⅲ-1、Ⅲ-2)注意事项】有关细胞培养注意事项：1.本实验自始至终要严格进行无菌操作，不能抱有任何侥幸心理，器皿和器械一旦有污染的可能，要勤换或在酒精灯上勤烧烤配液时所使用的三角瓶瓶口、吸管等都要注意在酒精灯上烧烤2.配制液体调试PH值时，要少量多次加入NaHCO3 经免过量偏碱造成不必要的液体浪费3.待细胞分装到培养瓶后，要在瓶壁的上面做好标记，以便区分细胞的贴壁面，严防在细胞换液时培养液未覆盖到细胞面上，造成细胞干枯死亡4.实验操作前，净化台或无菌室要进行紫外灯照射消毒20分钟5.实验所用物品，要求全部进行无菌处理6.培养过程中要随时注意培养箱的温度，严格控制在37℃±0.57.在细胞培养操作过程中严禁说话另还应注意：1.PHA的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键,不同来源或同一厂家的不同批号、不同的保存时间,PHA的效价可能会有较大的差异,直接影响培养细胞中分裂细胞的数量故每批PHA正式使用前,须进行一次预实验,摸索PHA的质量和使用量其使用量不宜过大,否则会导致红细胞凝集。
一般,自己直接从菜豆中提取的PHA效果较好2.接种的血样标本愈新鲜愈好肝素用以抗凝,用量不宜过多3.秋水仙素用量和作用时间要适当该药有强烈的毒性作用,用量过大、作用时间过长,可使染色体缩短和发生异常分裂现象,甚至染色体破碎4.低渗是制片好坏的重要环节低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体的制片质量、如染色体分散不好、有胞浆背景,或细胞破损、染色体丢失等要注意低渗液使用前需37℃ 温箱预温5.低渗后的预固定也很重要,预固定时,固定液量不要多,加人固定液后要立即用吸管吹打均匀,用力不要过猛另外两次固定时,固定液也不要过多,吹打时用力也不要过猛,以免细胞破碎,染色体丢失固定液要在使用时配制6.最后的滴片也是染色体制片好坏的很关键的一步载玻片上有油污或预冷不够,或滴片时所滴悬液重叠、操作不好,或底物悬液过浓等都直接影响细胞、染色体的分散底物悬液过稀或酒精灯上烤片时间太长,都可能造成制片中可供分析用的染色体很少,甚至找不到染色体思考题与作业】1.血培养中无菌操作不严格将会造成什么后果?2.血培养中PHA所起的作用是什么?秋水仙素的作用是什么?3.简述血培养和外周血淋巴细胞染色体标本制备的过程。
4.制备良好的染色体标本应注意哪些问题？5.每位同学上交两张人类外周血淋巴细胞染色体标本制片实验二 人类染色体的形态观察与非显带核型分析【实验目的】1.掌握人类染色体的形态数目和分组特征2,掌握染色体计数和性别鉴定方法3.掌握正常人体细胞染色体非显带核型的分析方法实验原理】人类非显带染色体核型分析是染色体研究中的基本方法它可根据染色体的数目、结构进行核型分析,而对染色体病患者做出初步的诊断可在显微镜下直接做出判断,也可进行显微照相,经冲洗、放大后,根据照片进行分析人类染色体的命名是根据丹佛(Denver)及伦敦(London)会议提出的标准,按照染色体的长度和着丝点的位置,将染色体配对并按长度依次排列、分组、编号人体细胞含有46条染色体,即23对,其中22对为常染色体,男、女相同,编为1~22 号,另一对为性染色体,男、女有别,男性为XY,女性为XX 根据着丝点的位置及其相对长度可将22 对常染色体分为A、B、C、D、E、F、G7个组性染色体可根据它们的形态、大小编入组内,X染色体编入C组,Y染色体编入G组在剪接配对制备核型图时,性染色体可单独排列将照片上的染色体按其轮廓剪下,并根据它们的大小和着丝点的位置,进行配对、分组、排列、并贴在报告纸上,而构成了染色体核型图。
根据每个染色体的正常形态特征,检查分析染色体核型正常与否,即为核型分析核型分析后,将其分析结果按国际标准进行描述实验准各】器材与用品:剪刀、镊子、剪贴纸、尺子、胶水、铅笔、橡皮实验材料】正常人外周血淋巴细胞非显带中期分裂相照片实验内容】一、正常人体细胞染色体的观察与计数每位同学发一张正常人外周血淋巴细胞非显带(中期分裂相)染色体照片(附录),进行染色体观察和计数染色体在细胞周期中经历着凝缩和舒展的周期性变化在细胞分裂中期,染色体高度凝缩,从而轮廓、结构清晰典型,易于观察分析每一中期染色体由两条染色单体组成,借着丝粒而彼此相连由着丝粒将每条染色单体分为两个染色体臂,分别称为长臂(q)和短臂(p)染色体臂上有较狭窄而浅染的区域称为次缢痕,D、G组染色体短臂末端连有一个球形小体——随体短臂和随体相连处为次缢痕又称副缢痕(图Ⅵ-1、Ⅵ-2)正常人每一个体细胞都含有46条染色体,可根据照片上染色体的自然分布,划分为几个区域,便于染色体计数将各区域的染色体计数总合起来,即为该分裂相的染色体总数二、染色体大小及着丝粒位置判断原则上讲染色体大小,从A到G组,依次递减A组染色体最大,B、C、D、E、F组染色体逐渐减小,G组染色体最小。
着丝粒是分辨非显带染色体的一个重要指标1960年在美国丹佛会议上制定了三个参数,其中有二项与着丝粒位置有关:①臂率:即用长臂与短臂的长度之比来表示臂率=长臂长度/短臂长度②着丝粒指数:即短臂之长度与该染色体全长之比着丝粒指数=短臂长度/该条染色体全长简单快速判断:着丝粒位于染色体纵轴的1/2~5/8处者,称为中着丝粒染色体；着丝粒位于染色体纵轴的5/8~7/8处者,称为亚中着丝粒染色体；着丝粒位于染色体纵轴的7/8至近末端的,称为近端着丝粒染色体三、性别判断经常根据最小的近端着丝粒染色体的数量判断性别由于Y染色体的大小及着丝粒位置介于G组因而,如观察到G组样染色体5条即可初步判断为男性,如仅为4条即可初步判断为女性。