第三章第三章 核酸Nucleic Acid王骊丽u DNA碱基顺序的测定u RNA碱基顺序的测定第四节 核酸碱基序列顺序分析 (Sequence analysis of nucleic acids)DNA 碱基顺序测定的基本步骤uDNA 片断的制备uDNA碱基顺序测定DNA 片断的制备由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割或能够用于测定的小片段，共包括部分：◆ DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的小片段（300-500bp)；◆ PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情况下，以获取一定数量用于序列测定返回Ø 杂交测序法Ø 质谱法Ø 单分子测序法Ø 原子探针显微镜测序法Ø DNA 芯片法 化学降解法 (Maxam-Gillbert法,1977)双脱氧链终止法 (sanger法,1977)新技术方法核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis经典方法一、以化学裂解反应为基础—化学降解法基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离；分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经经放射自显显影即可在X胶片上读读出DNA链链的序列。
主要两个步骤骤：碱基选择选择 性水解；对对水解产产物DNA小片段进进行电电泳分析和碱基顺顺序的推断• 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鸟嘌呤核苷；• 肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3´-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应• 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基特异性碱基化学切割反应(1)• G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落• G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌 呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落 • T+C反应：肼（低盐）• C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp特异性碱基化学切割反应(2)化学裂解法测定DNA的核苷酸序列返回二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被 测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终止 技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链 ，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的DNA 小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基顺序 。
主要步骤包括：末端终止法合成不同长度 DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析1977年sanger发明末端终止法“加减法”Sanger双脱氧终止法DNA酶法测序DNA自动测序仪Sanger法发展过程1、“加减法”测定DNA序列的原理☺ 以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引 物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三磷 酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记（ 例如32PdATP) ,再加入DNA聚合酶IKlenow片断；☺ 从引物3′端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记 的dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去 反应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份，分别进行加减法反应系统少一个－OH脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构2、双脱氧链终止法基本原理：☺ 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂；☺ 将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为模板，需要引物 、 DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂) ；☺ 在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。
分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段返回3、DNA酶法测序☺ 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同 的引物以及四种脱氧核苷酸；☺在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链☺ 四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示： DNA酶法测序三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射 出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依 此确定DNA碱基的排列顺序 第一步 加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁 跑得快ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。
第二步 荧光检测• DNA 带负电 • DNA在电泳胶中 的迁移率与其片段 大小有关DNA自动测序结果RNA 碱基顺序测定方法• RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；• 逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶 纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常 用cDNA 表示)；• 用化学降解法 或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺 序，再得出RNA的碱基顺序应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上 的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定杂 交 测 序一、化学正在向生命科学领域渗透 二、DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉 煌, 曾两次获得诺贝尔奖而后基因组的研究工作 是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家 更大的创造力！分析化学的新发展正在发展的几种测序方法 1）毛细管电泳激光荧光法2）超薄层板电泳激光荧光法3）八聚体测序技术4）转录测序5）质谱法6）原子探针显微镜7）流动式单分子荧光检测法8）芯片测序• 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料 ，经水解，测定核苷酸组成及比例；• 先以外切酶确定5′- 或3′-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸 组成、比例和序列；• 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个 核酸分子的核苷酸序列。
核酸碱基顺序测定酶底物作用部位作用产物外切酶磷酸二酯 酶DNA，RNA5′端，5 ′连接处3 ′核苷酸 3 ′端，3 ′连接处5 ′核苷酸 内切酶脱氧核糖 核酸酶 IDNA3 ′连接处3 ′ -羟核苷酸为3 ′末端寡 核苷酸及剩余部分 脱氧核糖 核酸酶II5 ′连接处3 ′ -核苷酸为3 ′末端寡核 苷酸及剩余部分 核糖核酸酶T1RNA5 ′连接处碱基是G3 ′ -鸟苷酸为3 ′末端寡核 苷酸及剩余部分 核糖核酸酶 I5 ′连接处碱基是 Pyr3 ′ -嘧啶类核苷酸为3 ′末 端寡核苷酸及剩余部分返回第五节 核酸的催化性质 The catalytic properties of nucleic acids核酶（Ribozyme）•核酶的发现 •核酶的催化性质 •核酶的研究中的两个问题核酶的发现• Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而 RNA部分在有足够浓度Mg2+离子存在下，能起核酸水解酶的作用• Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种具有自催化性能的核酶• 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子核 酶u 催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧 核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
u 催化性RNA (ribozyme) • 序列特异性的核酸内切酶 • 参与RNA转录后加工修饰 • 作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA 核酶的催化性质• RNA作用于RNA• 核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等• 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等核酶的催化过程图转酯作用转酯作用核酸酶是指所有可以水解核酸的酶Ø 依据底物不同分类 •DNA酶(deoxyribonuclease, DNase) •RNA酶 (ribonuclease, RNase) Ø 依据切割部位不同分类•核酸内切酶：限制性核酸内切酶非特异性核酸内切酶•核酸外切酶：5´→3´或3´→5´核酸外切酶u参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 u负责清除多余的、结构和功能异常的核酸， 同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组DNA技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解核酸酶的功能 The crystal structure of the L1 ligase ribozyme. (Credit: M. Robertson and W. Scott (Science, March 16, 2007)“谁先出现的呢，核酸还是蛋白质？ ”这个问题先前被看作是一个极难处理的矛盾，但随着核酶的发现，现 在可以想象一个生命起源以前的 ‘RNA世界’，那里自我复制的酶执行两种功能。
《科学》杂志期刊X射线衍射技术确定核酶晶体结构 • The Structural Basis of Ribozyme-Catalyzed RNA Assembly – Michael P. Robertson and William G. Scott Science 16 March 2007: 1549-1553. A SYNTHETIC RIBOZYME CATALYZES THE BOND FORMATION NECESSARY FOR RNA SYNTHESIS BY TRANSITION-STATE STABILIZATION AND ACID-BASE CATALYSIS, PERHAPS AS IN AN EARLY RNA WORLD. Abstract »| Full Text »| PDF »| Supporting Online Material »| • 核酶催化效率太低• 由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解 酶(RNase)所破坏• 因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或 作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究 工作核酶的研究中的两个问题。