试验三 微生物的接种、分别纯化与培育方法试验目的：学习把握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分别、纯化菌种的方法试验内容：一、接种将微生物接到适于它生长生殖的人工培育基上或活的生物体内的过程叫做接种 １、接种工具和方法在试验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的外形，有刀形、耙形等之分有时滴管、吸管也可作为接 种工具进展液体接种在固体培育基外表要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒〔图３－３〕图３－３ 接种和分别工具1. 接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１〕划线接种 这是最常用的接种方法即在固体培育基外表作来回直线形的移动，就可到达接种的作用常用的接种工具有接种环，接种针等在斜面接种和平板划线中就常用此法２〕三点接种 在争论霉菌形态时常用此法此法即把少量的微生物接种在平板外表上， 成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观看、争论它们的形态除三点外，也有一点或多点进展接种的３〕穿刺接种 在保藏厌氧菌种或争论微生物的动力时常承受此法做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培育基一般是半固体培育基它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种， 沿半固体培育基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线四周能够生长４〕浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培育皿中，然后再倒入冷却至 45°C 左右的固体培育基，快速轻轻摇匀，这样菌液就到达稀释的目的待平板凝固之后，置适宜温度下培育， 就可长出单个的微生物菌落５〕涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，快速用涂布棒在外表作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的 菌落６〕液体接种 从固体培育基中将菌洗下，倒入液体培育基中，或者从液体培育物中，用移液管将菌液接至液体培育基中，或从液体培育物中将菌液移至固体培育基中，都可称为液体 接种７〕注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病８〕活体接种 活体接种是特地用于培育病毒或其它病原微生物的一种方法，由于病毒必需接种于活的生物体内才能生长生殖所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织， 例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。
接种的方式是注射，也可以是拌料喂养２、无菌操作培育基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具〔如接种针和吸管等〕在无菌条件下接种含菌材 料〔如样品、菌苔或菌悬液等〕于培育基上，这个过程叫做无菌接种操作在试验室检验中的 各种接种必需是无菌操作试验台面不管是什么材料，一律要求光滑、水平光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼 脂培育基时利于培育皿内平板的厚度保持全都在试验台上方，空气流淌应缓慢，杂菌应尽量 削减，其四周杂菌也应越少越好为此，必需清扫室内，关闭试验室的门窗，并用消毒剂进展 空气消毒处理，尽可能地削减杂菌的数量空气中的杂菌在气流小的状况下，随着灰尘落下，所以接种时，翻开培育皿的时间应尽量 短用于接种的器具必需经干热或火焰等灭菌接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上 充分烧红〔接种柄，一边转动一边渐渐地来回通过火焰三次〕，冷却，先接触一下培育基，待 接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，快速地接种到的培育基上〔图３－４〕然后，将接种环从柄部至环端渐渐通过火焰灭菌，复原不要直接烧环，以免残留在接 种环上的菌体爆溅而污染空间平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培育皿的盖翻开一小部分进展接种。
在向培育皿内倒培育基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶 口应倾斜一下在火焰上通过图３－４ 斜面接种时的无菌操作(1) 接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞二、分别纯化含有一种以上的微生物培育物称为混和培育物〔 Mixed culture〕假设在一个菌落中全部细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培育〔 Pure culture〕在进展菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培育物得到纯培育的过程称为分别纯化，方法有很多种１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取肯定量的稀释液与熔化好的保持在 40~50°左右的养分琼脂培育基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培育皿中，待凝固之后，把这平板倒 置在恒箱中培育单一细胞经过屡次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步 骤数次，便可得到纯培育物〔图３－５， a〕图３－５ 倾注平板法〔a〕涂布平板法〔b〕图解1.菌悬液 2.熔化的培育基 3.培育物 4.无菌水２、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取肯定量的稀释液放在无菌的已经凝固的养分琼脂平 板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培育基外表上，经恒温培育便可以得到单 个菌落。
〔图３－５， b〕３、平板划线法最简洁的分别微生物的方法是平板划线法用无菌的接种环取培育物少许在平板上进展划 线划线的方法很多，常见的比较简洁消灭单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、 放射法、四格法等〔图３－６〕当接种环在培育基外表上往后移动时，接种环上的菌液渐渐 稀释，最终在所划的线上分散着单个细胞，经培育，每一个细胞长成一个菌落〔图３－７〕４、富集培育法富集培育法的方法和原理格外简洁我们可以制造一些条件只让所需的微生物生长，在这 些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进展竞争，在生长力量方面远远超过其他微 生物所制造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等在一样 的培育基和培育条件下，经过屡次重复移种，最终富集的菌株很简洁在固体培育基上长出单菌 落假设要分别一些专性寄生菌，就必需把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生 长通过屡次重复移种便可以得到纯的寄生菌图３－６ 平板划线分别法1. 斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法５、厌氧法在试验室中，为了分别某些厌氧菌，可以利用装有原培育基的试管作为培育容器，把这支 试管放在沸水 0 浴中加热数分钟，以便逐出培育基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进展接种接种后，参加无菌的石蜡于培育基外表，使培育基与空气隔绝另一种方法是，在接种后，利用 N 或 CO2 2取代培育基中的气体，然后在火焰上把试管口密封有时为了更有效地分别某些厌氧菌，可以把所分别的样品接种于培育基上，然后再把培育皿放在完全密封的厌氧培育装置中三、培育微生物的生长，除了受本身的遗传特性打算外，还受到很多外界因素的影响，如养分物浓 度、温度、水分、氧气、ＰＨ等微生物的种类不同，培育的方式和条件也不尽一样１、影响微生物生长的因素微生物的生长，除了受本身的遗传特性打算外，还受到外界很多因素的影响影响微生物 生长的因素很多，简要介绍如下1) 养分物浓度细菌的生长率与养分物的浓度有关:μ=μmax*C/(K+C) 养分物浓度与生长率的关系曲线是典型的双曲线K 值是细菌生长的很根本的特性常数它的数值很小，说明细菌所需要的养分浓度格外之低，所以在自然界中，它们处处生长然而养分太低时，细菌生长就会遇到困难，甚至还会死 亡这是由于除了生长需要能量以外，细菌还需要能量来维持它的生存这种能量称为维持能 另一方面，随着养分物浓度的增加，生长率愈接近最大值２〕温度在肯定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长 温度和最高生长温度。
在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样微生物只 有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短超过最低生长温度，微生物不会生长， 温度太低，甚至会死亡超过最高生长温度，微生物也要停顿生长，温度过高也会死亡一 般状况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的但也常受其它环境条件的影响而发生变化依据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型： a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-10℃－20℃之间 b.中温微生物：其最适生长温度一般在 20℃－45℃之间c.嗜热微生物：生长温度在 45℃以上３〕水分水分是微生物进展生长的必要条件芽孢、孢子萌发，首先需要水分微生物是不能脱离 水而生存的但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中各种微生物在不能生长 发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域４〕氧气依据微生物对氧气的需要状况，可将它们分为以下五个类型 a.需氧微生物这类微生物需要氧气供呼吸之用没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生 物也是有毒的很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长绝大多数 微生物都属于这个类型b. 兼性需氧微生物这类微生物在有氧气存在或无氧气存在状况下，都能生长，只不过所进展的代谢途径不同 罢了。
在无氧气存在的条件下，它进展发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵c. 微量需氧微生物这类菌是需要氧气的，但只在 0.2 大气压下生长最好这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用d. 耐氧微生物这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死 c.厌氧微生物这类微生物在生长过程中，不需要分子氧分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制， 就是被杀死２、培育方法 1〕依据培育时是否需要氧气，可分为好氧培育和厌氧培育两大类好氧培育：也称“好气培育”就是说这种微生物在培育时，需要有氧气参加，否则就不 能生长良好在试验室中，斜面培育是通过棉花塞从外界获得无菌的空气三角烧瓶液体培育 多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中厌氧培育：也称“厌气培育”这类微生物在培育时，不需要氧气参与在厌氧微生物的培育过程中，最重要的一点就是要除去培育基中的氧气一般可承受以下几种方法：a. 降低培育基中的氧化复原电位：常将复原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，参加到培育基 中，便可到达目的。
有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑参加到培育基中，也可适 合厌氧菌的生长b. 化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸取氧气；用磷吸取氧气；用好 氧菌与厌氧混合培育吸取氧气；用植物组织如发芽的种子吸取氧气；用产生氢气与氧化合的方 法除氧c. 隔绝阻氧：深层液体培育；用石蜡油封存；半固体穿刺培育d. 替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气； 用混和气体驱代氧气２〕依据培育基的物理状态，可分为固体培育和液体培育两大类固质培育：是将菌种接至疏松而富有养分的固体培育基中，在适宜的条件下进展微生物培 养的方法液体培育：在试验中，通过液体培育可以使微生物快速生殖，获得大量的培育物，在肯定 条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。