免疫组化在病理诊断中 的正确应用周晓军 南京军区南京总医院引言•免疫组化技术已广泛应用于病理诊断：l在解决疑难病例诊断方面起着重要作用；l随着人们医疗风险意识的增强，许多普通的病 例也常常需要免疫组化进一步证实；l成为病理医生常规工作不可缺少的重要工作； 常规手段；引言•免疫组化技术广泛应用于病理诊断工 作得益于免疫组化技术的进步：l抗原修复技术；l更加敏感的检测系统或放大系统的建立；l更多可用于常规标本的抗体的出现；l快捷地抗体流通及良好的售后服务引言•肿瘤病理诊断：lHE形态（标准模糊） ：经验、权威＝主观 性强lHE形态 + 特染，电镜lHE形态 + 免疫组化 + 分子病理？•免疫组化：l新的诊断标准！l更客观！更权威！l肿瘤分类有了本质的区别l有了客观标准作为对照， 再不仅仅靠积累经验, 专家l大大缩短学习周期l年青人有了更多的机会！引言•Experience based? Experience--Evidence based! •The days of saying “It is what it is because I say it is” are gone!•病理诊断进入新时代！ •当代合格的病理医生l临床知识 lHE形态知识 l免疫组化知识l分子病理知识引言 •目前国内免疫组化在病理诊断应用中 存在的问题亟待解决:l技术操作不规范，缺乏室内、室间质控l不充分了解应用范围l知识更新太快：每年12000篇新的文献 （2005年, 人体病理），知识老化！l简单化！抗体选择及结果判断失误l过分或单纯依赖免疫组化！忽视临床、 HE结合！•带来新的误诊！不做误诊更多！必须做！但要正确应用 ！一、免疫组化的应用范围•肿瘤的病理诊断：l帮助良恶性病变鉴别；l未分化恶性肿瘤（癌或肉瘤）性质的判断；l各种圆细胞、梭形细胞、多形性肿瘤的鉴别 诊断；l帮助确定转移性肿瘤的原发部位等。
CKAE3T GCK20 CK7 肺结肠癌转移细胞角蛋白: CK 7 and 20CK7+ CK7 - CK20+ 泌尿上皮癌，卵巢黏液癌， 消化道癌 （结肠） 部分胃癌，部分胰胆道癌 Merkel细胞癌CK20- 消化道以外的腺癌：肺、 肝癌、肾细胞癌、前列乳腺、浆液性及宫内膜癌 ， 腺癌、鳞状细胞癌间皮瘤、膀胱、宫颈、胰腺 内分泌癌（除甲状腺）唾腺来源的癌(90%)透明细胞癌的免疫组化鉴别肾透明细胞癌肝透明细胞癌肾上腺腺瘤卵巢透明细胞癌HEPPAR1-+--CD10++--34βE-12---+Inhabin-/+-+-Melan-A--+ -EMA++-+pCEA-+-+/-CK19+/---+CK7---+CK8/CK18++-+一、免疫组化的应用范围•淋巴造血系统疾病的 诊断：l鉴别反应性增生性疾 病与淋巴瘤；l各类淋巴瘤分型的重 要依据•在淋巴造血疾病的病 理诊断中免疫组化目 前已成为常规开展的 工作项目 Bcl-2 Bcl-2一、免疫组化的应用范围•内分泌肿瘤的诊断：不仅可以帮助确定 诊断，还可以通过检测肿瘤分泌激素达 到功能分类的目的。
•在软组织肿瘤、神经系统肿瘤等其他各 系统肿瘤的病理诊断中免疫组化也具有 重要的作用 一、免疫组化的应用范围•小活检病理检查：能明确地显示癌细胞的 存在（如胃粘膜活检中的印戒细胞癌）； 肿瘤穿刺活检时肿瘤类型的确定•微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓）、 甚至不易察觉的病变得以确诊 CgAEMAM, 54, 胃大 弯溃疡CD3，CD20， CD68均散在细胞 阳性，数量不等活检手术类癌SCC类癌活检手术CK类癌SCCCgA类癌SCCSCCSCCTTF-1 类癌Ki－67 类癌活检标本类癌和小细胞癌的相对鉴别特点 类癌 小细胞癌肿瘤部位 中央或周围 中央多见 核染色质 颗粒状，有时粗糙 细致、均匀 血管 薄壁 厚壁、肾小球样 核分裂像 ≤10/10HPF ＞ 10/10HPF CgA, Syn 阳性强 阳性弱 Ki-67 低（典型的＜20%） 高（典型的＞50%）From AJSP 2005, 29(2):179-187一、免疫组化的应用范围•细针穿刺、细胞学诊断主要是定性 诊断？•免疫组化的应用有可能对部分肿瘤 进一步地进行分类或明确来源。
LCA一、免疫组化的应用范围•乳腺癌激素受体（ER、PR）的检测在指 导临床治疗方面已起到了重要的作用•针对肿瘤基因产物（C-erbB2, P53, ALK， CD117等）的抗体为基因治疗提供重要 的参考依据•细胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫组化染 色可为肿瘤的预后提供依据已用于临床的新型靶向治疗药物•美罗华：CD20单克隆抗体，用于治疗 CD20+的B细胞淋巴瘤•Herceptin：c-erbB-2（neu）单克隆抗 体，用于治疗c-erbB-2过度表达的乳腺 癌•STI-571（Gleevec，imatinib）：小分 子选择性蛋白酪氨酸激酶抑制剂，用于 CML和GIST治疗一、免疫组化的应用范围•某些感染性疾病的病因诊断，如HBV、 HCV、EBV、CMV等病毒的检测•但与分子生物学等技术相比，免疫组化 检测病原微生物敏感性常常较差，因此 应用范围有限 HPVHBsAg二、免疫组化的局限性•对于许多非肿瘤性疾病由于常常无特异 的抗原表达，因此其诊断仍依据于特异 的常规光镜及电镜形态表现，如肾小球 肾炎的诊断，多种感染性疾病、各种代 谢性疾病，细胞内/外异常物质沉积性疾 病（如淀粉样变性），肌活检诊断等； 二、免疫组化的局限性•至今无绝对特异的抗体！•相当多的肿瘤缺乏特异的抗原表达；•同一种抗原常常可在多种肿瘤中表达，•不少肿瘤又由于分化太差或细胞分子结构 改变而不表达相关的抗原。
二、免疫组化的局限性•不同抗体滴度有不同的阳性结果：lHBME-1 1:100 (推荐浓度)间皮膜阳性 ，几乎所有腺癌胞浆阳性l1:2000~15000 仅仅间皮膜阳性•内源性生物素：假阳性（胞浆），如肝 细胞及肝细胞癌不同克隆ER表达差异SP16F11二、免疫组化的局限性•免疫组化的标准 化（同一实验室 及不同实验室间 结果的一致性） 、定量结果的判 断等还存在不少 的问题尚待解决 三、如何正确应用免疫组化 •正确、有价值的免疫组化结果：l免疫组化实验室规范、合适的技术操作（包 括组织固定、抗原修复、检测系统、各类试 剂的质量保证，染色技术等）是最重要的基 础保证；l但病理医生在组织块的选择，抗体的选择， 结果的判断等方面也起着不容忽视的作用 三、如何正确应用免疫组化 1、组织块的选择•首选有典型病变、分化较好、固定较好 的组织块•应尽量选择有正常组织（有内对照组织 ）的蜡块•对固定时间较长或未及时固定的组织， 冻融后的组织或脱钙后的组织应尽可能 地避免使用 2. 抗体的选择•经验性、知识性要求很高的一项艺术工作•选择到－组织合适的抗体—费用最小而又能完全 达到目的•病理医生须通过认真观察HE切片并联系临床相 关信息，准确地列出要鉴别的几种可能性诊断。
l病理医生对HE形态要熟练掌握，知识面广，既不能 撒大网似的罗列出太多的诊断，使费用增加过多；也 不能遣漏可能的诊断，造成误诊或再选择抗体延迟报 告时间 大细胞未分化癌？CK，EMA……恶黑？S100，HMB45……淋巴瘤？CD20，CD3……CK+,EMA+,S100-, HMB45- CD20-,CD3-, 诊断：大细胞未分化癌ALCL？CD30，ALK1……CD302. 抗体的选择•另一方面病理医生要对各种抗体的免疫反应 谱及交叉反应（更重要！！）都十分熟悉：l如CK不仅表达于上皮还可表达于肌纤维母细胞 ，平滑肌细胞，间皮下细胞……等•并熟知各种肿瘤的免疫表型（包括异常的免 疫组化表达!） CKCD312. 抗体的选择•如何了解各种抗体的 免疫反应谱及各种肿 瘤的免疫表型？l产品目录 ？l专业书籍 ？l新的文献 √l专家咨询 √l网上检索 √2. 抗体的选择•至今无绝对特异的抗体！ •无100%病例或肿瘤细胞阳性的抗体！•选择一组抗体而不是一个抗体 •“交叉阳性”的原则：如癌与恶性黑色素瘤鉴别：l选一个或二个低分化癌表达阳性而恶黑阴性的抗体， 如CK、EMA，l同时还要选一个或二个恶黑表达阳性而癌表达阴性的 抗体，如S－100，Melan-A。
l若染色结果与预期结果矛盾则应考虑其他的诊断或核 查免疫组化染色是否有问题 2. 抗体的选择•抗体选择不仅要选准，还要选足l一个可能的诊断要选2个或多个抗体，以防 肿瘤异常免疫表达造成误诊如淋巴瘤分类 诊断时，一组抗体中至少要包括2个以上的T 细胞及B细胞标志（CD3、CD43、CD20、 CD79a/Pax-5等） CD432. 抗体的选择•先采用一线抗体，先 确定一定的范围，再 应用二线抗体进一步 明确诊断？l可能由于一线抗体选 择太少，部分肿瘤有 交叉反应而导致开始 就犯导向性的错误， 最终导致误诊EMAKappa 轻链2. 抗体的选择•选择同一类抗体时还要考虑到各种抗体的敏感 性及特异性l首选当然要选敏感性及特异性都好的抗体，但有些 特异性虽然不高但有很高敏感性的抗体在不少情况 下可能发挥更重要的作用如S－100l不同公司生产的同一类抗体可能敏感性及特异性有 所不同，或要求的抗原修复方法等技术条件不同， 应根据本实验室预试验结果进行选择 3. 结果的判断•免疫组化染色最终是否能得到正确的结 论，关键还要看对染色结果如何评价（ 解释）同一种染色结果可有不同的病 理诊断•应该首先核查一下染色反应是否成功（ 这也是免疫组化室内质控的一个重要步 骤）。
l评价染色反应是否成功最好比较同一张切片 中存在的正常组织，即所谓的内阳性对照 CKpanCD20SMA?CK-7!SMACD3 CD203. 结果的判断•有不少染色或病例缺乏内阳性对照，若 对染色反应有疑问只能选用另外的阳性 对照片核实•若内（或外）阳性对照组织免疫反应阴 性，瘤组织阳性则表明假阳性；瘤组织 阴性则表明假阴性•只有阳性对照染色阳性瘤组织反应才属 真实 3.结果的判断•除了内阳性对照，还要看内阴性对照是 否有非特异反应•内源性生物素造成的非特异染色（如在 肝、肾及富含线粒体的细胞等），常常 表现为非特异的胞浆阳性•总之，只有阳性对照染色阳性，阴性对 照组织又基本阴性，这样的免疫组化染 色结果才可信 desmindesminSMA3. 结果的判断 •其次，要分析阳性染色的部位（细胞的微解剖 部位）是否正确: l如许多淋巴细胞的标志（CD20，CD43，CD5， CD45RB，CD30，C-erbB2等）应为膜阳性，若胞 浆弥漫阳性间或细胞核阳性则为假阳性l反之，有的抗体染色应为核阳性（如ER，PR，TdT ，Cyclin D1等），若胞浆或胞膜阳性也为假阳性l还有的抗体可表现为二种阳性反应类型，如S－100 ，ALK可为核阳性也可伴有胞浆阳性；CD30， CD15即可表现为细胞膜阳性，也可表现为核旁高尔 基区阳性。
C-erbB-2E-cadherinCD20CD30PR ERTDTTTF-1P 53Ki-67Me l-AMel-panALK-1ALK-1ALK-1ALK-1CD30CD15CEACEAC-Kit/CD1173. 结果的判断•随着对免疫反应靶分子部位的更深入了解，免 疫反应的形态也是重要的参考依据，l如嗜铬蛋白A，细胞毒标志（粒酶B，穿孔素，TIA －1）等阳性反应在胞浆内应呈颗粒状，l而CD79a等为胞浆弥漫阳性，l细胞角蛋白染色阳性应为胞浆细丝状，l若反应类型不符可能也要怀疑为假阳性•但要精。