抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则一、基本原则1. 抗肿瘤药物分类⑴ 细胞毒类药物(cytotoxic agent):包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构 酶及作用于微管系统的药物等；⑵ 生物反应调节剂(biological response modifier)；⑶肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)；⑷肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)；⑸ 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)；(6) 分化诱导剂(differentiation inducing agent)；(7) 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)；(8) 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)2. 抗肿瘤药物药效学需研究内容2.1 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验2.2 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以 做出正确的结论2.3 I 类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究二、体外抗肿瘤活性试验1. 试验目的1.1 对候选化合物进行初步筛选；1.2 了解候选化合物的抗瘤谱；1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。
2. 试验方法 选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度， 按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT还原法、磺 酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁 24 小时后再给药 试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为 溶媒对照3. 评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用 Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)体外试验至少重复一次 附注：评价药物抗癌活性的方法：1. MTT 还原法1.1 基本原理：四氮唑［MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide］是一种 能接受氢原子的染料活细胞线粒体中与 NADP 相关的脱氢酶在细胞内可将黄 色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲［月替］(formazan),而死的细胞则无此功 能用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲［月替］后，在一定波长下用酶标仪测定光密度 值,即可定量测出细胞的存活率。
1.2 操作步骤:，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成5000个/ ml的细 胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200卩1, 37°C, 5%CO2培养24 h1.2.2 实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的 培养基，每组设3〜5平行孔，37C, 5%CO2培养4〜5 d1.2.3弃去上清液，每孔加入200卩1新鲜配制的含0.2 mg / ml MTT的无血清培 养基.37C继续培养4 h小心弃上清，并加入200卩1 DMSO，用微型超声振荡 器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570 nm，参比波长为450 nm测定光密度值 1.3 结果评定 :按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％=(1- OD实验/0D对照)X100% 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求 出样品的半数杀伤浓度IC50合成化合物或植物提取纯品的IC50V1O yg/m1 或植物粗提物的IC50V20 yg/m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作 用2. 生长曲线法的基本原理： 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间 作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。
随着细胞密度不断增高，由于代谢 产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定 期因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来3. 染料排斥试验的基本原理： 活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整 性的破坏，可被着色因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着 色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例4. 集落形成法的基本原理： 克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂 6 代或 6 代以上时，其后代所组 成的群体(集落)便含50 个以上细胞通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析 它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是 一种较理想的检测方法常用的集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种5. SRB 法的基本原理：SRB(sulforhodamine(3是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水SRB可与 生物大分子中的碱性氨基酸结合其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好 的线性关系故可用作细胞数的定量 MTT 法的一个缺点是 OD 值可随放置时 间而变，而SRB法无此现象因此更适用于进行大规模的试验。
三、体内抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植模 型或其它人癌小鼠模型试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评 定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空 纤维测定(hollow-fiber assay )等方法1. 动物 动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证雌雄均可，但同一批实 验中动物性别必须相同小鼠鼠龄为5-6 周，体重为18-22克评价同一物质的 活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠2. 肿瘤模型2.1 小鼠肿瘤模型淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、 Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌 CD8F1、艾氏腹水瘤(EAC)、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株 等2.2 人癌裸小鼠移植瘤模型应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验 模型建立和使 用应注意：(1) 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应 予了解。
2) 移植瘤复苏后一般应传 2-3 代后再用于体内抗肿瘤试验3) 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型(4) 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代3. 试验过程3.1 接种： 肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种3.1.1 皮下肿瘤模型选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下(超净台 或接种罩)，用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤将 瘤组织剪成1.5 mm3 左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细 胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为(1-5)X1063.1.2 腹水瘤模型无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例 稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为(1-5) X1063.1.3 原位接种模型 原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸 小鼠的肝脏原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法主 要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法3.2 动物分组3.2.1 试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。
3.2.2 治疗组设高、中、低三个剂量组小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随 机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100—300mm3 后将动物随机分组3.2.3 动物数普通小鼠每组 10 只，裸鼠 6 只 阴性对照组动物数为治疗组动物数x实验组数1/23.3 剂量设置3.3.1 治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1 设置，高剂量使用最大耐受 量或LD10的剂量3.3.2 阴性对照组给予相应的溶剂；3.3.3 阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，3.3.4 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳 性对照药3.4 阳性对照药选择原则 疗效确切；与被试物质化学结构类似；与被试物质有类似的作用机理3.5 药物配制 溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5N HC1)或碱(NaHC03、Na2CO3、NaOH)溶解，调节 pH 在 4.5-9.0 的范围 内用乙醇、丙二醇、吐温 80、 DMSO 助溶的药物，或用吐温 60、吐温 80、 2-3% 淀粉、 0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同 浓度的溶剂对照组。
用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射3.6 给药方案和给药途径 分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案给 药途径应与推荐临床用药的途径相同 给药次数较多，或被试物质溶解性较差， 静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途 径是有差别的 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径腹水瘤试验时一般 不能应用腹腔给药途径4 评价标准4.1 腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数如阴性对照组 20%动物 存活时间超过4 周，表明腹水瘤生长不良，实验作废采用中位生存时间(即 median survival time,MST )来评价每组的生存时间 ，其 计算公式为：每组鼠数的中间数-中间生存天数前死亡的鼠数MST=(中间生存天数-0.5) +中间生存天数死亡的鼠数治疗组与对照组的比较，采用T/C (%)来表示，计算公式为：T MSTT/C % = xlOO%C MSTT MST：治疗组MST ； C MST:阴性对照组MST评价标准以125%为界，当T/C%>125%时视为有效，反之则无效4.2 裸鼠移植瘤模型 推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。
肿瘤直径的测量次数 根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周 2-3次,每次测量同时还需称鼠重肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = l/2xaxb2 或 n/6xaxb"其中 a、b、c 分别表示长宽高两公式的相关性极好，可采用任一公式根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume， RTV)， RTV = Vt /V0其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿 瘤体积抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C(%)TRTVT/C % = xlOO%CRTVTRTV:治疗组RTV ； CRTV:阴性对照组RTV疗效评价标准：T/C % >60 %为无效；T/C % <60%，并经统计学处理PvO.05为 有效4.3 小鼠肿瘤模型 生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法 生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价试验结束后处死动物，称体重，解 剖剥离瘤块，称瘤重阴性对照组肿瘤平均瘤重小于 1 克，或 20%肿瘤重量小于 400 毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废疗效评价公式:给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率= 。