β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷葡萄糖苷酶催化合成红景天苷 1、研究背景、研究背景2、论文创新点、论文创新点3、结果与讨论、结果与讨论4、主要结论与建议、主要结论与建议 1、研究背景、研究背景v 红景天苷是中药红景天中的主要有效成分，在抗缺氧、抗疲劳、抗心肌缺血、提高机体免疫力等方面具有显著效果目前红景天苷来源有植物来源、化学法合成和酶法合成（图1）三种2004年，Tong等利用苹果籽粉β-葡萄糖苷酶以酪醇和葡萄糖为底物首次进行了合成，反应完成后红景天苷浓度可达；此后，Yu 在叔丁醇体系中实现了1.9 g/L/d的时空产率；王梦亮在缓冲溶液-叔丁醇体系中反应50 h后产物浓度达到6.0 g/L；刘璘等人在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中产物浓度达到了12.4 g/L 图1 酶催化糖基化合成红景天苷 2、论文创新点、论文创新点v（1）对来源于苦杏仁中的β-葡萄糖苷酶在含离子液体体系中的酶学性质进行相关研究，有关研究未见报道v（2）对在离子液体-有机溶剂混合反应介质中β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究尚未见相关报道 3、结果与讨论、结果与讨论1、含离子液体介质中酶学性质研究2、离子液体-有机溶剂-缓冲溶液体系中酶法催化 合成红景天苷 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v 酶在不同反应介质中的活力往往具有显著差异。
通过调节离子液体的阴阳离子组成、极性和浓度等可以改变酶的活力v 目前，对糖苷酶在离子液体中酶学性质的研究尚处于起步阶段v 研究含离子液体反应介质中β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯基-β-D葡萄糖苷（pNPG）的反应特性，以期为酶催化合成糖苷的研究提供理论指导 缓冲溶液体系中的酶学性质缓冲溶液体系中的酶学性质v缓冲溶液pH和反应温度的影响图2 缓冲溶液pH值对β-葡萄糖苷酶活力的影响 图3 缓冲溶液中温度对β-葡萄糖苷酶活力的影响50℃ 3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v离子液体种类和含量对酶活力的影响图4 离子液体种类及含量对β-葡萄糖苷酶活力的影响 3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v不同含量离子液体中反应温度对酶活力的影响图5 不同含量离子液体中温度对β-葡萄糖苷酶活力的影响50℃ 3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v含离子液体介质中pH对酶活力的影响图6 离子液体-缓冲溶液中pH值对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响 3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v离子液体对酶热稳定性的影响图7 离子液体-缓冲溶液中β-葡萄糖苷酶的热稳定性 3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v动力学参数测定图 8β-葡萄糖苷酶在缓冲溶液和60%C2MIm·BF4中的酶促动力学曲线通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umol·min-1·mg-1 ，Km为3.55mmol·L-1；而在含离子液体的反应体系中Vmax为3.55umol·min-1·mg-1，Km值为5.52mmol·L-1。
3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v由以上数据可得，在含离子液体的反应介质中酶催化水解pNPG的Km值变大，这可能是由于离子液体的加入增强了酶分子活性中心的刚性结构，致使酶与底物的“诱导契合”效应减弱，进而增大了反应所需要的底物浓度，导致在含离子液体反应介质中的Km值变大，Vmax值变小 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v （图1）显示，在传统水相中合成红景天苷因受水解-糖基化反应热力学平衡的限制而导致糖苷产物浓度较低以传统非水有机溶剂为反应介质是近几年酶催化生物合成的研究热点，但非水有机溶剂中存在以下困难：（1）β-葡萄糖苷酶、底物、产物均易溶于水，难溶于有机溶剂；（2）在极性有机溶剂中，酶的溶解性、活性和稳定性差；（3）高浓度葡萄糖对酶具有抑制作用，且容易生成二糖因此，选择适当的反应介质实现在同一个反应体系中协调以上困难之处，是实现高效率合成的关键 v 与传统有机溶剂及电解质相比，离子液体具有一系列的突出优点，而离子液体的可设计性使离子液体成为非常规反应介质的优秀候选者 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v离子液体种类对糖基化反应的影响图9 离子液体种类对酶催化糖基化反应的影响Note：1-control；2-C1MIm·MeSO4；3-C2MIm·BF4；4-C4MIm·BF4；5-C6MIm·BF4；6-C4MIm·PF6；7- C6MIm·PF6； 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v有机溶剂种类对糖基化反应的影响图10 有机溶剂种类对酶催化糖基化反应的影响Note：1-control；2-叔丁醇(log P，粘度：，30℃)；3-1,4-二氧六环(log P，粘度：，20℃)；4-二甲基亚砜(log P，粘度：，20℃)；5-二甲基甲酰胺(log P，粘度：，25℃)；6-四氢呋喃(log P，粘度：，20℃) 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v离子液体和有机溶剂体积比图11 离子液体/1,4-二氧六环体积比对酶催化糖基化反应的影响1:4 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v缓冲溶液含量对糖基化反应的影响图12 缓冲溶液含量对酶催化糖基化反应的影响15% 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v反应温度对糖基化反应的影响图13 温度对酶催化糖基化反应的影响50℃ 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v底物浓度对糖基化反应的影响图14 底物浓度对酶催化糖基化反应的影响220g/L100g/L 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v金属离子种类和浓度对糖基化反应的影响图15 金属离子种类酶催化 糖基化反应的影响 图16 Mg2+ 浓度酶催化糖基化反应的影响5mmol/L 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v传质效率对糖基化反应的影响图17 振荡速率酶催化糖基化反应的影响275rpm 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v糖基化反应动力学参数测定图18 不同反应介质中动力学参数 通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 μmol·h-1·mg-1，Km为0.31 mol·L-1，KI为1.16 mol·L-1；而在含15%缓冲溶液和含17%C4MIm·PF6 的1,4-二氧六环反应介质中Vmax为2.03μmol·h-1·mg-1，Km值为0.45 mol·L-1，KI为0.17 mol·L-1。
离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v以上现象可能与底物的去溶剂化和过渡态稳定化的能量有关由于离子液体的存在，可能导致反应介质中的水活度低于含缓冲溶液的1,4-二氧六环中的水活度，因而极性底物D-(+)-葡萄糖在后者的基态能量更低，从而引起反应的活化能垒提高，最大反应速率Vmax下降，且反应底物与酶结合能力的Km也下降，底物抑制常数KI上升，导致临界底物抑制浓度下降除此之外，该现象还可能与底物的扩散性、酶结构的变化及酶的构象可塑性的变化等因素也有关系 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v糖基化反应的时间进程图19 酶催化糖基化反应的时间进程120h 4、主要结论v1、含离子液体反应介质中，β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50℃， pH值为，离子液体的加入在一定程度上增加了该酶的热稳定性能；v2、通过Lineweaver-Burk作图法得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umol·min-1·mg-1 ，Km为3.55mmol·L-1；而在含60% 离子液体的反应体系中Vmax为3.55umol·min-1·mg-1，Km值为5.52mmol·L-1。
由此可见， 离子液体的加入对酶与底物的缔合造成了一定的阻碍作用，减慢了水解反应速率 4、主要结论v3、β-葡萄糖苷酶催化D-(+)-葡萄糖和对羟基苯乙醇合成红景天苷的反应介质最佳组成为离子液体C4MIm·PF6的含量为17%，柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液含量为15%，有机溶剂1，4-二氧六环含量为68%在pH值、振荡速率为275rpm、底物葡萄糖和对羟基苯乙醇浓度分别为100g/L和220g/L、金属Mg2+浓度为5mmol/L条件下，反应120h后红景天苷最大浓度可达到；v4、通过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 μmol·h-1·mg-1，Km为0.31 mol·L-1，KI为1.16 mol·L-1；而在含15%缓冲溶液和含17% C4MIm·PF6的1,4-二氧六环反应介质中Vmax为2.03μmol·h-1·mg-1 ，Km值为0.45 mol·L-1 ， KI为0.17 mol·L-1 。