胰 岛 素 （三）胰岛素（（三）胰岛素（Insulin）） 胰岛素广泛存在于人和动动物物的的胰胰脏脏中，正常人的胰脏约含有200万万个胰岛，胰岛由α-、、β-和和δ-三三种种细细胞胞组组成成，其中β-细胞制造胰胰岛岛素素，α-细胞制造胰胰高高血血糖糖素素和胰胰抗抗脂脂肝肝素素，δ-细胞制造生生长长激激素素抑抑制制因因子子胰岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前前体体胰胰岛岛素素原原存在的，进而分解分解为胰岛素进入血液循环1) 结构和性质结构和性质 胰岛素由51个氨基酸组成 不同种属动物的胰岛素分分子子结结构构大大致致相相同同，主要差别在A链链二二硫硫桥桥中中间间的的第第8、、9和和10位位上上的的三三个个氨氨基基酸酸及及B链链C末末端端人人的的是是苏苏氨氨酸酸，，猪猪的的是是丙丙氨氨酸酸,抗抗原原性性比比其他来源的胰岛素要低 (2) 胰岛素的性质胰岛素的性质 ①①白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体②牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784胰岛素的等电点为等电点为5.3~5.4③ 胰岛素在pH4.5～～6.5范围内几乎不溶于水范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸易溶于稀酸或稀碱溶液；在或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解以下乙醇或丙酮中溶解；在在90%以上以上乙醇或乙醇或80%以上丙酮中难溶以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。
乙醚中不溶④④在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定⑤⑤水溶液中胰岛素分子受水溶液中胰岛素分子受pH、温度、离子强度的影响产生聚、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态合和解聚现象在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态锌胰岛素在锌胰岛素在pH=2的水溶液中呈二聚体，聚合作用随的水溶液中呈二聚体，聚合作用随pH升升高而增加，在高而增加，在pH=4-7时聚合成不溶性无定形沉淀时聚合成不溶性无定形沉淀在高浓高浓度锌度锌的溶液中，pH6～～8时胰岛素溶解度急剧下降 ，pH大于9时解聚并由于单体结构改变而失活 ⑥在pH=2的酸性水溶液中加热至80-100度，可发生聚合而转变为无活性的纤维状胰岛素，如及时用冷0.05mol/L氢氧化钠处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶⑦具有蛋白质的各种特殊反应；胰岛素能被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活⑧多种还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素C及多种重金属等都能使胰岛素分子中二硫键被还原、游离氨基被酰化游离羧基被酯化和肽键水解而导致胰岛素失活⑨胰岛素对高能辐射非常敏感；能被活性炭、白陶土、氢氧化铝、磷酸钙、CMC等吸附。
（（1）工艺流程：）工艺流程： 2、生产工艺、生产工艺 （（2）工艺过程及控制要点）工艺过程及控制要点 3、质量检验（1）原料质量控制①不同种类和年龄的动物，胰脏中胰岛素的含量有差别②采摘胰岛素要保持腺体组织的完整；离体后要立即深冻，先在-30度以下急冻后转入-20度保存备用2）生产过程质量控制 浓缩工序的条件对胰岛素收率影响很大，尽量缩短浓缩液受热时间（3）产品性状（4）产品纯度要求①常规的结晶胰岛素纯度不够高，需进一步层析纯化采用超细Sephadex G-50凝胶过滤②美、英药典主要控制两个指标，即相对分子质量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素原国外一般要求胰岛素原核脱酰胺胰岛素含量在10*10-6，1000*10-6以下 4、胰岛素制剂 新剂型：眼用膜剂、鼻腔给药的气雾剂、直肠用栓剂以及口服的脂质体、微囊、乳剂等5、酶促半合成人胰岛素 6、重组DNA技术 另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素•蛋白质工程①胰岛素分子中取代一个氨基酸残基，防止单体二聚化，由此合成的新型胰岛素在药物浓度下基本上保持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素快2-3倍②胰岛素B链第10位His变为Asp，受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的262%和235%。
（四）生长素①人生长素对人肝细胞有增加核分裂作用，对人红细胞有抑制葡萄糖利用的作用，对人白细胞或淋巴细胞有促进蛋白质和核酸合成的作用，有促进骨骼，肌肉，结缔组织和内脏增长的作用②动物生长素能促进家禽生长，增加产量，在畜牧业领域有很好的应用前景③不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长素对人有活性④目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，产品已投向市场 1、结构和性质①人的生长素是由一条191个氨基酸的多肽链所构成的蛋白质，分子中有两个二硫键，相对分子量21700.等电点4.9.②胰岛素N端的1-134氨基酸肽链段位活性所必需，C端的一段可能起保护作用，使生长素在血液循环中不致被酶所破坏③人生长激素分子相对稳定，冰冻下活性可保持数年2、生产工艺 （2）工艺过程 （五）白细胞介素-2和白细胞介素①白细胞介素是介导白细胞间相互作用的一类细胞因子，是淋巴因子家族的一员②目前已有IL-1—18，目前对IL-1—6研究较多③目前上市的白细胞介素只有IL-2④IL-2是由辅助T细胞经抗原或丝裂原等刺激，在巨噬细胞或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的糖蛋白。
⑤IL-2能诱导T细胞增殖与分化，刺激T细胞分泌γ-干扰素，增强杀伤细胞的活性，在调节免疫功能上具有重要意义临床上用于治疗一些免疫功能不全以及癌症的综合治疗，另IL-2对创伤修复也有一定的作用 1、IL-2结构与性质①人IL-2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时，含有20个氨基酸的信号肽被切除，产生成熟的IL-2分子②IL-2分子质量为15420，不同来源的IL-2分子不均一③在人IL-2的第58、105、125位是Cys，其中第58、105形成分子内二硫键，这对保持其生物活性是必不可少的④IL-2在pH=2-9范围内稳定，对各种蛋白酶均敏感，对DNA、RNA酶不敏感⑤重组IL-2因细菌缺少翻译后的修饰功能都不是糖蛋白，相对分子质量为14000，PI大部分为7.7⑥应用蛋白质工程技术在IL-2中125位的Cys分别由Ser或Ala取代，可制成生物活性、热稳定性和复性效果都比原IL-2强的新型白介素 2、传统生产工艺、传统生产工艺 （（1）工艺路线：）工艺路线： 4、基因工程IL-2的制备（1）IL-2基因结构（2）cDNA克隆的制备①从ConA激活的人白细胞T细胞株提取高活性IL-2mRNA作为模板。
逆转录单链cDNA②经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA末端连接若干dCMP残基，引物存在下，利用DNA聚合酶成双链cDNA③分离cDNA片段，G-C加尾法基因重组 （3）IL-2的表达和纯化①利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞已经成功表达了重组人IL-2②工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体，离心沉淀收集包涵体包涵体主要含由IL-2单体分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的重组IL-2无活性③重组IL-2可用6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素使包涵体变性解聚成单分子，再利用空气氧化或用1.5 mol/L还原型谷胱甘肽复性恢复IL-2二硫键和正常分子结构，获得生物活性 ④重组IL-2的进一步纯化有如下几种方法•利用IL-2的疏水性，经超滤浓缩后利用反相高效液相层析和较高浓度的乙腈（60%）的流动相进行梯度洗脱，可得高纯度的IL-2•通过受体亲和层析一步纯化，可得到纯度为95%以上的IL-2•用7 mol/L尿素溶解IL-2包涵体得到上清夜，上清液经Sephadex G-100凝胶过滤和W650蛋白质纯化洗脱DEAE离子交换层析，最终得到均一的IL-2，纯度达到98%。